作者：李庆华，魏春雁 ，黄九林，李建东
【摘要】 目的测定东北松嫩草原和辽河入海口野生罗布麻叶总黄酮和槲皮素含量，并对其抗氧化活性进行比较。方法超声波辅助提取总黄酮，比色法和hplc分别测定总黄酮和槲皮素含量，dpph·和·oh清除法评价抗氧化活性。结果松嫩草原和辽河入海口罗布麻叶总黄酮含量分别为10.593～11.001mg·g-1，11.203mg·g-1；槲皮素含量分别为5.507～5.753mg·g-1，5.218mg·g-1。松嫩草原罗布麻叶总黄酮抗氧化活性较强。结论辽河入海口和松嫩草原野生罗布麻叶总黄酮、槲皮素含量差异不显著，松嫩草原野生罗布麻叶总黄酮具有较强的抗氧化活性。
【关键词】 罗布麻叶； 总黄酮； 槲皮素； 抗氧化
abstract：objectiveto determine the contents of total flavonoids and quercetin from leaves of apocynum venetum collected from songnen grassland and liao river mouth area respectively. their antioxidant capacities were compared.methodsultrasonic extraction were applied to extract total flavonoids. a spectrophotometric method was used to measure total flavonoids, and content of quercetin was determined by hplc. the antioxidant capacities of the extracts of total flavonoids from leaves of apocynum venetum towards free radical scavenging were evaluated by 1,1-diphenyl-2-icrylhydrazyl(dpph) and hydroxyl radicals.resultsthe results showed that leaves of apocynum venetum collected in songnen grassland and liao river mouth area (10.593-11.001 mg·g-1 and 11.203 mg·g-1 respectively) both possessed higher amounts of flavonoids and the contents of quercetin from theirs were of 5.507-5.753 mg·g-1 and 5.218 mg·g-1 respectively. in addition, leaves of apocynum venetum wildly growing in songnen grassland showed higher antioxidant activity as compared to that of liao river mouth area. conclusionthere is no significant difference in the contents of total flavonoids and quercetin from leaves of apocynum venetum between both areas, however, leaves of apocynum venetum wildly growing in songnen grassland show higher antioxidant activity as compared to liao river mouth area, further study of the correlation between antioxidant capacity and the ratio of the content of quercetin to total flavonoids is required.
key words： apocynum venetum; total flavonoids; quercetin; antioxidant ability
心脑血管疾病、癌变、衰老以及各种退行性疾病的发生和发展都与自由基在体内产生过多，同时机体对自由基的防御能力不足有密切关系［1］。wWw.11665.cOm外源性抗氧化剂可以提高人体的抗氧化能力，清除体内过多的自由基，黄酮类化合物是一类天然抗氧化剂，具有高效低毒的特点。罗布麻apocynum venetum l.为夹竹桃科植物，叶含有金丝桃苷、异槲皮素、槲皮素-3-o-槐糖苷、芸香苷、槲皮素等多种黄酮成分。本实验测定了东北松嫩草原和辽河入海口处野生罗布麻叶总黄酮和槲皮素含量，并比较了其抗氧化活性，为更好的开发利用罗布麻资源提供参考。
1 仪器与试药
1.1 仪器
lc－10atvp高效液相色谱仪（日本岛津）：双泵、柱温箱、spd-10avp检测器、sil-10advp自动加样器、class-vp色谱工作站；uv-2201紫外分光光度计（日本岛津）；re-52a型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。
1.2 药品
1,1-二苯基苦基苯阱（dpph·）和2-脱氧核糖购于西格玛公司上海办事处；槲皮素和芦丁购于中国药品生物制品检定所；除用于hplc的乙醇和甲醇为色谱纯外，其余的药品和试剂均为国产分析纯。
1.3 材料
2006-08-30分别采集于辽河入海口的盘锦和松嫩草原长岭县的绿源草场、种马场（松嫩草原生境变化较大，分别在草甸和轻盐碱化草甸设两个采样点），样品经东北师范大学草地科学研究所植被生态教育部重点实验室李建东教授和李志坚副教授共同鉴定。
2 方法
2.1 超声波辅助法提取总黄酮鲜样用自来水冲净后于60℃恒温鼓风干燥箱中干燥至恒重，干燥的样品用粉碎机粉碎，过1.2 mm的筛子。
取粉碎样品5.0 g，加无水甲醇150 ml，室温下超声波辅助提取30 min，过滤。滤渣重新加无水甲醇150 ml，相同条件下再提取一次。合并两次提取液，40℃减压蒸干。用50％的乙醇重新溶解，去除叶绿素，滤液用50％乙醇定容至50 ml，摇匀，作供试样品液备用。每个样品依上述条件重复3次。
2.2 比色法测定总黄酮含量总黄酮含量的测定用改进的dowd方法［2］。精密称取在120℃干燥至恒重的芦丁对照品，配制浓度依次为0，10，20，30，40，50，60 mg·l-1的系列标准溶液，取标准溶液3.0 ml，加入同体积2% alcl3甲醇溶液，室温下反应15 min，415 nm测定吸收值，做标准曲线，得出方程y=0.011 3x+0.003 8，r2=0.999，线性范围为0～60 mg·l-1。
精密吸取上述供试品溶液3 ml，按标准曲线项下操作，于415 nm波长处测定吸光度值，并由标准曲线计算含量。样品中总黄酮含量表达为罗布麻叶每克干重中芦丁等价物的含量(mg re﹒g-1 fm)表示，每个样品平行测定3次。
2.3 hplc测定槲皮素含量色谱条件：ods-c18色谱柱；流动相：甲醇-乙醇-水（48∶45∶7）；流速：0.8 ml·min-1；进样量：20μl；柱温：25℃；检测波长：370nm［3］。hplc图见图1。
配制浓度为0，25，50，75，100 μg·ml-1槲皮素甲醇标准溶液，依据峰面积（y）为纵坐标，槲皮素进样量（μg）为横坐标（x）进行回归，得回归方程：y=69953x-3 449.4，r2=1.000。槲皮素对照品在0.5～20 μg范围内线性关系良好。
前述总黄酮提取液稀释至合适比例后经0.45μm滤膜过滤后的滤液用于测定槲皮素含量，自动加样器精密吸取供试液20μl注入高效液相色谱仪，按前述色谱条件测定，样品中槲皮素含量由回归方程得出。样品中槲皮素含量表达为罗布麻叶每克干重中含有多少毫克槲皮素（mg qe﹒g-1 fm），每个样品平行测定3次。
2.4 dpph·自由基清除活性测定方法配制浓度为0.1mol ·l-1的dpph·甲醇溶液，1 ml提取液中加入2 ml的dpph·溶液，室温下反应30min后用紫外分光光度计于517 nm处测定吸光值。每个样品平行测定3次。抑制率计算公式：
抑制率（%）=［(c-cb)-(s-sb)］(c-cb)×100%
c为标准液的吸光度值；cb为空白液的吸光度值；s为样品反应液的吸光度值；sb为对照液的吸光度值。
2.5 ·oh清除活性测定方法·oh清除活性的测定采用轻微改进的2－脱氧核糖氧化法。反应混合试剂包括5mmol· l-1 feso4，5mmol ·l-1 edta和5mmol ·l-1 2-脱氧核糖各0.2 ml，与0.2 ml提取液混合，加入0.1mol· l-1磷酸盐缓冲液(ph7.4)1.0 ml后，再加入0.2 ml的5mmol ·l-1 h2o2，37℃保温4 h后，加1.4%三氯乙酸、0.5%硫代巴比妥酸各1 ml。反应混合物放到沸水浴中煮沸10 min。532 nm处测吸光值。每个样品平行测3次。抑制率的计算公式：
抑制率(%)=［(c-cb)-(s-sb)(c-cb)］×100%
c为标准液的吸光度值；cb为空白液的吸光度值；s为样品反应液的吸光度值；sb为对照液的吸光度值。
3 结果与分析
3.1 黄酮类化合物含量测定结果罗布麻生态适应能力强，分布广泛，生境差异较大，有效成分的积累与气候、土壤和降雨量等生态环境因素有关，与采收期也密切相关。从表1可见，辽河入海口和松嫩草原野生罗布麻叶总黄酮和槲皮素含量均较高。槲皮素在总黄酮中的比率松嫩草原显著高于辽河入海口处。表1 东北不同产地野生罗布麻叶总黄酮和槲皮素含量（略）
3.2 抗氧化活性测定结果
dpph·是一种人工合成的稳定自由基，由于其在可见光区有特征吸收峰，对dpph·的淬灭能力可以有效地评价抗氧化剂的活性。羟自由基是最活泼，对机体危害最大的自由基。
各样品对dpph·和·oh的抑制率折合计算为ic50值（不加样品的反应体系的清除率设为0%，清除50%dpph·或·oh时抗氧化剂的浓度为此样品的ic50值）。用ic50显示不同样品清除dpph·或·oh的能力，ic50值越小，样品对dpph·或·oh清除能力越强。
从图2可见，松嫩草原野生罗布麻叶总黄酮对dpph·的清除活性略高于辽河入海口处，对·oh的清除活性显著高于辽河入海口处的野生罗布麻叶。
4 讨论
东北松嫩草原和辽河入海口处野生罗布麻叶总黄酮和槲皮素含量均较高，并具有较强的抗氧化活性，可以作为提取用于药品、食品领域高效能天然抗氧化剂的潜在资源。罗布麻叶本身含有一定量的槲皮素，其主要的黄酮类化合物如金丝桃苷、异槲皮苷等均是以槲皮素为苷元的，水解后测定的槲皮素含量为槲皮素的总量，松嫩草原野生罗布麻叶总黄酮和槲皮素含量与黄河入海口处差异不显著，却具有较强的抗氧化活性，是否与槲皮素在总黄酮中较高比率有关，有待深入研究。
【参考文献】
［1］郑荣梁，黄中洋.自由基生物学，第3版［m］.北京：高等教育出版社，2007：6.
［2］盛 萍，王新玲，杨学斌，等.罗布麻总黄酮提取工艺的优选［j］.时珍国医国药，2006，17（4）：587.
［3］miao m，cheng-lin h，shu-qing an，et al．seasonal, spatial, and interspecific variation in quercetin in apocynum venetum and poacynum hendersonii, chinese traditional herbal teas［j］.agric. food chem,2003,51：2390.
