作者：吴剑，李华，涂硕，余乐涵，万福生
【摘要】 目的观察白英水提物（slt）对胃癌sgc-7901细胞凋亡及相关基因表达的影响。方法常规法制备白英水提物；实验分正常对照组、白英处理组和顺铂处理组。白英处理组加入白英水提物终浓度分别为12.5，25和50 mg/ml。mtt法检测细胞增殖抑制率，荧光显微镜观察sgc-7901细胞凋亡及形态变化，半定量rt-pcr分析基因bcl-xl，bid，caspase-9 和caspase-3 mrna表达。结果与正常对照组比较，3个剂量白英处理组sgc-7901细胞增殖抑制均有显著性增加，且呈明显的时效和量效关系，细胞凋亡呈显著性增多（p<0.05），表现细胞核固缩、染色质凝集、边聚等；基因bcl-xl mrna表达显著性下降（p<0.05）， bid、caspase-9 和caspase-3 mrna表达有显著性升高（p<0.05），并随白英浓度增加而加强。结论白英能剂量依赖性的抑制sgc-7901细胞增殖和诱导凋亡，其作用可能与调控bcl-xl、bid、caspase-9和caspase-3 mrna表达相关。
【关键词】 白英； sgc-7901细胞； 凋亡； 基因表达
abstract：objectiveto investigate the effects of solanum lyratum thunb. extract (slt) on apoptosis of human stomach cancer sgc-7901 cells.methodsdried whole herbs of solanum lyratum thunb were extracted by boiling distilled water. human stomach cancer sgc-7901 cells were randomly divided into control group, slt-treated groups (12.5 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml ) and positive control(25μg/ ml ddp ). the growth inhibitory rate was evaluated by mtt assay. morphological changes of apoptosis were observed with fluorescence microscope. cell apoptosis rate was determined by flow cytometry and the express of bcl-xl , caspase-9 ,caspase-3 and bid mrna were detected by semi-quantity rt-pcr.resultscompared with control group, the cell proliferation inhibitory rate and apoptosis rate of human stomach cancer sgc-7901 cells were increased obviously (p<0.05) in slt-treated groups. morphology of sgc-7901 cells showed the nuclear shrinkage, chromatin condensation and margination, and no changes were observed in control group. the expression of bcl-xl mrna was obviously decreased (p<0.05), the expression of caspase-9 ,caspase-3 and bid mrna were obviously increased respectively (p<0.05), in a dose-dependent manner in sgc-7901 cells of the slt-treated groups. conclusionslt can induce apoptosis and inhibit proliferation of the human stomach cancer sgc-7901 cells,by regulating expression of bcl-xl, caspase-9 ,caspase-3 and bid genes.
key words：solanum lyratum thunb.; stomach cancer sgc-7901; apoptosis; gene expression
白英（solanum lyratum thunb.，slt）为茄科多年生草质藤本植物，又称白毛藤。WWw.11665.Com白英作为传统抗癌中药在肿瘤治疗方面应用广泛而且历史悠久，其主要成分含有甾体皂苷类、生物碱类及有机酸等多种化合物，具有抗肿瘤、抗炎、抗过敏等药理作用［1］。本实验室曾发现白英水提物能诱导宫颈癌hela细胞和肺癌a549细胞凋亡［2，3］，但它对胃癌细胞凋亡的作用尚未能阐明。本实验以人胃癌sgc-7901细胞为研究对象，旨在探讨白英水提物的抗癌作用特点及其机制。
1 材料
人胃腺癌细胞株sgc-7901购于中科院上海细胞生物研究所。rpmi 1640培养基、胎牛血清(fbs)、胰蛋白酶为gibco公司产品；碘化丙啶(pi)、蛋白酶k(proteinase k)和核糖核酸酶a(rnase a)、hoechst 33342 为sigma公司产品；四甲基偶氮唑蓝（mtt）（上海普飞生物技术有限公司），trizol试剂为invitrogen公司；顺铂为锦州九泰药业有限责任公司产品；pcr引物由上海生物工程公司合成。wellscan k3型酶标仪（khb lab-systems，芬兰），pcr仪（杭州郎基公司产），dyy－6c型电泳仪（北京六一仪器厂产），紫外透射反射分析仪（上海精科实业有限公司），gis-2009全自动数码凝胶图像分析系统（上海天能科技有限公司）。
2 方法
2.1 白英水提取物（slt）的制备
取白英(购买于江西南华医药有限公司中药材分公司，产地安徽)干品80 g，用800 ml水浸泡60 min，加热沸腾60 min，200目网筛过滤弃药渣，滤液以4 000 r/min的速度离心20 min× 2次，取上清液，浓缩至80 ml，调ph值为7.0～7.2，0.22 μm过滤除菌，所得液体为药物原液，生药含量为白英水提物1.0 g/ml,分装10 ml/瓶，-20℃保存备用。
2.2 细胞培养和实验分组
人胃腺癌sgc-7901细胞，以含100 u/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、10% fbs的rpmi 1640培养液，在37℃，含体积分数为5% 的co2饱和湿度培养箱中培养，取对数生长期的细胞进行实验。实验分正常对照组、白英处理组和阳性对照组。其中正常对照组的培养细胞不加药物处理，只加含10% fbs的rpmi 1640培养液；白英（slt）处理组又分3个不同剂量组，在含10%胎牛血清rpmi 1640培养液中，加入白英水提物的终浓度分别为12.5，25，50 mg/ml；阳性对照组加入含25 mg/l 顺铂的rpmi 1640培养液。
2.3 细胞毒试验(mtt法)
以含100 u/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、10%胎牛血清的rpmi 1640培养液，37℃，5%co2培养箱中培养hela细胞。取对数生长期细胞移入96孔培养板，细胞密度为1×104/ml，每孔加入细胞悬液200 μl，培养箱中培养24 h后，吸弃孔内原培养液，加入含白英水提物或顺铂的10%胎牛血清rpmi 1640培养液200 μl。各药物浓度组分别设10个平行复孔，另设1个空白对照孔。分别培养24，48，72 h和96 h，每孔加入mtt液（5 mg/ml）20 μl，继续培养4h后终止培养，弃上清，加入二甲基亚砜150 μl终止反应，用酶标仪（波长490 nm）测定吸光度（od）值，计算细胞增殖抑制率：抑制率（%）=（1－od药物/od对照）×100%。
2.4 sgc-7901细胞中基因bcl-xl，bid ，caspase-9和caspase-3 mrna分析
在pubmed上查找待检测的基因（主要是cdna）序列和内参gapdh（磷酸甘油醛脱氢酶）序列，借助引物设计软件primer premier 5.0 设计正义和反义引物（见表1）。按trizol reagent试剂盒使用说明书提取sgc-7901细胞总rna。经逆转录后，分别取cdna产物2 μl，正、反义引物各1 μl(10 μm)，2×taq pcr master mix 12.5μl,加ddh2o 6.5 μl, 总反应体积25 μl。pcr反应条件： 94℃3 min; 94℃45s, 56℃45s, 72℃45s，38个循环；结束前72℃延伸10 min。然后，各取pcr产物9 μl，加10×loading buffer 1 μl，经1.5%琼脂糖凝胶（含eb 0.5 μg/ml）电泳，电压为40 v，时间40 min，用紫外透射分析仪观察并拍照。通过gis-2009全自动数码凝胶图像分析系统分析各条带的光密度，以gapdh的表达量为对照计算并比较各组细胞中基因bcl-xl和bid mrna的相对表达量。表1 rt-pcr引物序列（略）
2.5 统计学处理 所有实验结果数据均用±s表示，采用spss 13.0统计软件对实验数据进行处理，分析方法采用t检验分析，以p﹤0.05为有统计学意义。
3 结果
3.1 白英水提物对人胃癌sgc-7901细胞的生长抑制作用
细胞毒性实验结果显示，与正常对照组相比，白英各浓度组和顺铂组处理24～96h的细胞抑制率均有显著性升高（p<0.01）（见表2, 图1）。白英水提液（slt 12.5 mg/ml ）处理24，48，72 h和96 h的ic50分别为47.65，31.35，19.13，12.45 mg/ml。以上结果表明白英对人胃癌sgc-7901细胞增殖具有较强抑制作用，其抑制作用在一定范围内有时间－剂量依赖性。表2 白英水提液对sgc-7901细胞生长抑制率的影响（略）
3.2 白英水提物对人胃癌sgc-7901细胞凋亡作用
荧光显微镜观察可见：经3个不同剂量白英水提物和顺铂作用48h后，各组sgc-7901细胞呈核固缩，染色质凝聚，染色加深，呈环形或新月形附于核膜周围，并随白英剂量增加而加强，其中白英50mg/ml浓度组和顺铂组可见细胞核破碎，呈大小不等、形态不规则的荧光碎片，而正常对照组没有观察到染色质凝聚、浓染致密的颗粒块状荧光等现象（见图2）。表明白英能够诱导人胃癌sgc-7901细胞凋亡。
3.3 白英水提物对人胃癌sgc-7901细胞部分凋亡相关基因表达的影响
胃癌sgc-7901细胞经白英作用48h后， rt-pcr产物琼脂糖凝胶电泳显示，随白英浓度的升高，bcl-xl mrna条带逐渐变细变暗（见图3）；bid mrna,caspase-9 mrna和caspase-3 mrna 条带逐渐变粗变亮（分别见图4～6）；经光密度扫描分析可见(见表3)：sgc-7901细胞中bcl-xl/gapdh光密度积分值之比随白英浓度增加而逐渐降低的趋势（p﹤0.01）；bid/gapdh，caspase-9/gapdh，caspase-3/gapdh光密度积分值之比随白英浓度增加而增高的趋势（p﹤0.05或p﹤0.01）；提示白英对胃癌sgc-7901细胞中基因bcl-xl、bid、caspase-9和caspase-3 mrna水平有一定的调控作用。
4 讨论
近年来有关白英抗肿瘤作用的研究不断增多［2～5］。本研究采用mtt法观察了白英对人胃癌sgc-7901细胞增殖的抑制作用，结果表明，12.5，25，50 mg/ml白英对人sgc-7901细胞具有较强的抑制作用，且随着药物浓度的提高和作用时间的延长，抑制作用显著增高，表现出剂量和时间依赖性。荧光显微镜观察显示，白英各浓度组在处理sgc-7901细胞48 h后可见部分细胞体积缩小，胞浆凝缩，染色质嗜碱性增强凝聚成圆形、新月形附在核膜周边，核固缩呈均一的致密物，有些细胞还可见细胞核断裂，细胞膜起泡，包裹部分染色质以出芽的方式释放出凋亡小体等典型细胞凋亡特征。同时还观察到伴随着白英浓度的增高细胞数量逐渐减少，凋亡细胞则逐渐增多。表明白英呈剂量依赖性的诱导人胃癌sgc-7901细胞凋亡。表3 sgc-7901细胞 bcl-xl、bid、caspase-9和caspase-3 mrna表达变化（略）
细胞凋亡是一个多基因参与的细胞死亡过程，从启动到完成都受到多种基因的严格调控。在凋亡的信号传导途径中，目前已知的凋亡途径有线粒体途径、死亡受体途径和内质网途径。这3条传导途径中caspase (半胱氨酸蛋白酶) 家族起了至关重要的作用。caspase家族通常以低活性的酶原形式存在,通过不同方式被激活，特异性地裂解相关底物发挥放大并传递凋亡信号以及执行细胞凋亡的功能。而caspase-3在整个传导过程中处于核心地位，一旦 caspase-3被激活，即可作用于多种底物，继而引发一系列特异性凋亡。
细胞凋亡的线粒体途径受bcl-2基因家族的调控，bcl-2家族成员按结构和功能的不同，分为抑制凋亡的家族成员(包括 bcl-2，bcl-xl等)和促进凋亡的家族成员(包括bcl-xs、bax、bak、bid、bad和bim等) 两大类。这两类物质相互结合、彼此抑制，依据其数量的相对多少决定凋亡的发生与否。bcl-xl蛋白和bh3结构域凋亡诱导蛋白(bh3 interacting domaindeath agonist，bid) 都是bcl-2家族中的成员，在细胞线粒体凋亡途径中扮演着非常重要的角色。前者的作用是抑制凋亡，后者是促进凋亡。本实验结果显示，白英水提物作用sgc-7901细胞48 h后，bid mrna表达均上调，而bcl-xl mrna表达均下调。其作用程度随着药液浓度的升高而增大，表明白英水提物对bcl-xl和bid基因参与sgc-7901细胞凋亡有较好的调控作用。一方面，bcl-xl蛋白可以抑制线粒体上的一种高电导通道蛋白（mitochondrial transition pore, mtp）的开放，减少细胞色素c(cyt c)和凋亡诱导因子 (apoptosis inducing factor，aif)等的释放，从而抑制凋亡；而bid蛋白则可以增加线粒体膜cyt c和aif的释放［6～7］ 。其中cyt c与caspase9前体、凋亡活化因子(apoptosis protein activating factor，apaf1)组装成caspase凋亡复合体apoptosome，裂解活化caspase-9，再进一步活化下游的caspase-3，使之作用于多聚adp-核糖聚合酶［poly-(adp-ribose)polymerase，parp］，细胞进入不可逆的凋亡程序［9］；另一方面，bid蛋白还可以与线粒体胞质面的bcl-xl结合形成异二聚体，阻止bcl-xl和apaf结合，抑制其抗凋亡活性。此外，当fas/tnf介导的死亡受体被活化后，导致细胞中的bid被caspase-8切割形成具有活性的tbid (truncated tbid) ，并从细胞质逐渐向线粒体转位并寡聚到线立体 ［10］上，从而改变线立体膜的通透性，引起cyt c等释放［11，12］，诱导凋亡。可见，白英水提取物的抗癌作用机制可能与其调控癌细胞中基因bcl-xl，bid，caspase 9，caspase 3 mrna表达及其酶活性有关。
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