作者：钟宇飞，雷林生，余传林，朱正光，李建军， 吴曙光
【摘要】 目的 观察连翘水提取物及其各化学部位对s180肿瘤细胞以及脾细胞体外增殖的影响，为进一步的研究提供依据。方法 细胞增殖程度采用mtt比色法。结果 连翘水提取物（forsythia suspensa total extraction,fste）及乙醇溶解部位（fsⅳa）具有较强的抑制s180细胞增殖的作用，其余部位的作用较弱或无;fste和fsⅳa对小鼠脾细胞的增殖有明显的抑制作用。结论 连翘水提取物及其乙醇溶解部位对小鼠s180肿瘤细胞和小鼠脾细胞的体外增殖有明显抑制作用。
【关键词】 连翘 抗肿瘤 化学部位 免疫细胞 免疫抑制
abstract:objective to study the effects of forsythia suspensa total extract (fste) and chemical components of the extract on the proliferation of murine s180 sarcome cells and splenocytes in vitro to provide evidence for the further study. methods cell proliferation was detected with methyl thiazolyl tetrazolium assay (mtt). results fste and its ethanolsoluble extract (fsiva) had strong inhibitory effect on the growth of murine s180 sarcome cells, whereas petroleum ether extract，acetic ether extract， ethanolprecipitated extract showed weaker effects or no effects. and fste and fsiva also had distinct inhibitory effect on the growth of mouse splenocytes in vitro. conclusion fste and fsiva have marked inhibitory effect on the growth of mouse s180 tumor cells and splenocytes in vitro.
key words:forsythia suspensa; antitumor; chemical components; immunocyte, immunosuppression
连翘是常用的传统中药之一，为木犀科连翘属植物连翘（forsythia suspensa（thunb.）vahl）的干燥果实。www.11665.cOM文献报道连翘具有抗炎、强心等作用［1-3］，其抗肿瘤作用近年来开始受到关注，有研究证实连翘乙醇提取物具有体内外抗肿瘤作用［4-6］。考虑到中药实际应用时往往采用水煎剂，因此，本实验选取连翘的水提取物（forsythia suspensa total extract,fste）进行抗肿瘤作用的研究，并对其石油醚（fsⅰ）、乙醚（fsⅱ）、乙酸乙酯（fsⅲ）、乙醇溶解（fsⅳa）和乙醇沉淀（fsⅳb）等化学部位进行了抗肿瘤活性的筛选。免疫在机体抗肿瘤方面发挥着重要的作用，为此，同时进行连翘水提取物及其抗肿瘤有效部位对小鼠脾细胞体外增殖影响的观察，以初步考察其对免疫功能影响，为进一步的研究提供实验依据。
1 实验材料
1.1 肿瘤细胞株
小鼠s180肉瘤细胞由南方医科大学药学院药物研究所冻存。
1.2 药材
连翘购自肇庆市仁和医药公司，经肇庆医学高等专科学校药学系中药药剂师甘柯林鉴定为老翘。
1.3 主要试剂
rpmi1640培养基为gibco公司产品；新生牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品；四甲基偶氮唑盐（mtt）为sigma 公司产品；氟尿嘧啶注射液（5fu）为上海旭东海普药业有限公司生产，批号为070702；其余试剂为国产分析纯。
1.4 主要仪器
电子天平（上海上天公司，型号：fa2004）；高速冷冻离心机(美国杜邦公司，型号st21)；低速离心机（andreas hettich公司，型号：universal 16a）；连续波长酶标仪（biorad公司，型号：benchmark plustm）, co2培养箱（thermo公司 公司，型号：5410）。
1.5 动物
spf级近交系balb/c小鼠，雄性，8～10周龄，体质量（20±2）g，由南方医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：scxk（粤）20060015。
2 实验方法
2.1 连翘水提取物的制备
取连翘原药材（生药）300 g，加12倍蒸馏水3 600 ml煎煮1.5 h，滤过，再加入蒸馏水3 600 ml煎煮1.5 h，连续3次，合并煎煮液，减压浓缩，定容为1 g生药/ml，冰箱保存。此为连翘水提取物原液。实验时取上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后，用完全rpmi1640培养液稀释，使细胞培养时的终质量浓度分别为8，4，2，1，0.5，0.25 mg/ml（相当生药量）。
2.2 连翘水提取物各化学部位的制备
取连翘水提取物原液200 ml，依次用石油醚、乙醚、乙酸乙酯等进行萃取，剩余部位用φ=80%乙醇醇沉。分别得到石油醚部位fsⅰ、乙醚部位fsⅱ、乙酸乙酯部位fsⅲ、乙醇溶解部位fsⅳa和乙醇沉淀部位fsⅳb。实验时用完全rpmi1640培养基稀释（经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌），使得在细胞培养时，终质量浓度分别为8，4，2，1，0.5，0.25 mg/ml（相当生药量）。
2.3 实验分组
体外对小鼠s180肿瘤细胞增殖影响： 对照组（不加药组）、5fu组、连翘水提取物组（fste）、石油醚部位组（fsⅰ）、乙醚部位组（fsⅱ）、乙酸乙酯组（fsⅲ）乙醇溶解部位组（fsⅳa）、乙醇沉淀部位组（fsⅳb）。
体外对免疫细胞（小鼠脾细胞）增殖影响： 对照组（不加药组）、5fu组、连翘水提取物组（fste）、乙醇溶解部位组（fsⅳa）。
2.4 体外细胞增殖实验（mtt比色法）
2.4.1 小鼠s180细胞体外增殖实验 取冻存的s180细胞，经复苏培养，取对数生长期细胞，用rpmi1640完全培养基制成细胞悬液。调整上述细胞浓度为4.0×104个细胞/ ml,分别接种于96 孔板中100 μl，接种时用磁力搅拌器边搅拌边加样，培养24 h 后，分别加入上述6 种不同浓度的连翘水提取物各100 μl；空白对照孔仅含完全培养基，不含肿瘤细胞；实验对照孔仅含肿瘤细胞，不含任何药物；另设5fu对照孔（终质量浓度25 μg/ml）。每个浓度组及各对照组均设6个复孔。将培养板置于37 ℃、含5%co2 饱和湿度的培养箱中培养48 h后检测。培养结束前4 h每孔加入mtt（5 mg/ ml）20 μl，继续培养4 h，将细胞转移置ep管中，离心弃上清液后，每管加入二甲基亚砜200 μl，溶解紫色化合物，溶解液再转移置相应的96孔板孔中，微型振荡器振荡10 min，充分溶解，用全自动酶标仪于570 nm 波长处测定吸光度（a值）。按如下公式计算细胞抑制百分率。
抑制率(%)＝［1-(实验组a值-空白组a值)(实验对照组a值-空白组a值)］×100%
连翘水提取物的石油醚部位（fsⅰ）、乙醚部位（fsⅱ）、乙酸乙酯（fsⅲ）、乙醇溶解部位（fsⅳa）和乙醇沉淀部位（fsⅳb）的肿瘤抑制实验与水提取物相同。
2.4.2 小鼠脾细胞体外增殖实验 根据小鼠s180细胞体外增殖实验结果，选取连翘水提取物、乙醇溶解部位（fsⅳa）进行小鼠脾细胞体外增殖抑制实验。
取小鼠1只，拉颈椎处死，无菌取出脾脏放入盛有小量rpmi1640完全培养基的培养皿中，用2块玻片挟持捻碎，移入离心管中，经200目尼龙布滤过，滤液离心（1 500 r/min）收集细胞，用rpmi1640完全培养基洗3遍，计数，用rpmi1640完全培养基配成8×106个细胞/ml脾细胞悬液，并在已经加好待试药物以及空白对照、实验对照和5fu对照的每孔（96孔板）中加入100 μl，使每孔总液量为200 μl，置于37 ℃、含5%co2饱和湿度的培养箱中培养，48 h后检测，其余方法与上述小鼠s180细胞体外增殖实验相同。
2.5 统计学处理
采用spss 11.5统计软件中的单向方差分析（oneway anova）法对数据进行统计分析, 结果用（±s）表示，p<0.05为差异有显著性。
3 结果
3.1.1 连翘水提取物及乙醇溶解部位对小鼠s180肿瘤细胞体外增殖的影响 结果见表1，可以看出连翘水提取物（fste）和乙醇溶解部位（fsⅳa）有较强的抑制小鼠s180肿瘤细胞体外增殖作用，fste及fsⅳa含药量为8,4,2,1 mg/ml的实验组与对照组比较差异有显著性（p＜0.05），并呈现明显的量效关系。fste及fsⅳa含药量为8,4 mg/ml的实验组抑制作用较阳性对照组（5fu）强，其差异具有显著性（p＜0.05）。
表1 连翘水提取物及乙醇溶解部位对小鼠s180肿瘤细胞体外增殖的抑制作用（略）
table 1 inhibitory effects of aqueous extract and ethanolsolvable extract of forsythia suspensa on the proliferation of murine s180 sarcome cells in vitro
与对照组比较：*p＜0.05；与5fu组比较：#p＜0.05
连翘水提取物的石油醚部位（fsⅰ）、乙醚部位（fsⅱ）、乙酸乙酯（fsⅲ）和乙醇沉淀部位（fsⅳb）的实验数据与对照组比较，其差异无显著性，限于篇幅，结果未列出。
3.1.2 连翘水提取物（fste）和乙醇溶解部位（fsⅳa）对小鼠脾细胞体外增殖的影响 结果见表2，可以看出fste和fsⅳa有较强的抑制小鼠脾细胞体外增殖作用，fste及fsⅳa含药量为8,4,2,1,0.5 mg/ml的实验组与对照组比较差异有显著性（p＜0.05），并呈现明显的量效关系。fste含药量为8,4 mg/ml的实验组及fsⅳa含药量为8,4,2 mg/ml的实验组的抑制作用较阳性对照组（5fu）强，其差异有显著性（p＜0.05）。
表2 连翘水提取物及乙醇溶解部位对小鼠脾细胞体外增殖的抑制作用（略）
table 2 inhibitory effects of aqueous extract and ethanolsolvable extract of forsythia suspensa on the proliferation of mouse splenocytes in vitro
与对照组比较：*p＜0.05；与5fu组比较：#p＜0.05
4 讨论
近年来，连翘的抗肿瘤作用开始受到关注,研究表明连翘的乙醇提物具有体内外抗肿瘤作用［4-6］，至今已进行过体外筛选过的细胞株包括h22、smmc 27721、lovo、bgc823等肿瘤细胞株［4-6］。本研究观察到连翘的水提取物(fste)及其乙醇溶解部位（fsⅳa）有较强的抑制小鼠s180肿瘤细胞体外增殖作用,进一步证实了连翘抗肿瘤作用具有广谱性，并提示进行连翘的抗肿瘤药物的开发研究时也应注意其水提取物部分。
免疫在机体抗肿瘤方面的作用非常重要，本研究观察到fste和fsⅳa具有较强的抑制小鼠脾细胞体外增殖的作用，提示其可能对机体的免疫有抑制作用，这与张明远等的研究结果［5］有不一致的地方，这可能与所使用的连翘化学部位和研究模型的不同有关，有待进一步研究。
本研究是初步的，在后续的研究中，要对fste及fsⅳa进行多方面的体外和体内研究，才能确定其作为抗肿瘤药物开发的潜在价值。本实验用生药量来表示剂量是目前惯常的做法，但这不能准确反映连翘中抗肿瘤有效成分的含量，这给不同的实验研究以及与现有抗肿瘤药物的药效间比较带来不确定性，需要找到确定有效成分的定量指标或进一步分离纯化连翘的有效成分。
【参考文献】
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