作者：万焱，王启帅，杜绍亮，杨云
【摘要】 目的筛选壳聚糖对黄芩水提液的最佳纯化工艺，从而优化黄芩苷的提取工艺。方法以黄芩苷得重（得重= 粗品黄芩苷重量×黄芩苷浓度）为衡量指标，运用正交实验考察不同影响因素对絮凝效果的影响，同时采用hplc测定其含量对工艺进行系统评价。结果壳聚糖对黄芩水提液絮凝的最佳工艺条件：体系ph5，搅拌时间10 min，体系温度40℃，絮凝剂浓度0.5%。结论壳聚糖对黄芩水提液具有较强的絮凝作用，该方法简单可行，可提高黄芩药材的利用率。
【关键词】 壳聚糖； 黄芩苷； 水提液； 絮凝剂
黄芩scutcnana baicalensis georgi为唇形科植物黄芩的干燥根［1］，主要功效为清热燥湿、泻火解毒、止血安胎。黄芩中主要成分为黄酮类化合物，其中含量较高的有效成分有黄芩苷(baicalin)、汉黄芩苷(wogonoside)、黄芩素(baicalein)、汉黄芩素(wogonin)等。目前代谢研究表明，黄芩苷和汉黄芩苷为前药，黄芩素和汉黄芩素为二者的真正药效物质基础。wwW.11665.cOm药理学研究表明，黄芩具有多种药理作用，如抗菌、抗病毒、抗炎、抗变态反应、抗氧化、清除氧自由基、抗癌、抗肿瘤、抗凝、抗血栓形成和保护肝脏、心脑血管、神经元等作用，目前临床主要用于抗炎和抗菌。在现代中药生产中，经常使用酸沉法从中药黄芩中提取粗品黄芩苷来代替黄芩。但在黄芩水提液的酸沉过程中，水提液中的一些有机大分子杂质如淀粉、果胶、蛋白质等会随有效成分一起沉降下来，这就造成粗品黄芩苷中含有许多无效成分，降低了疗效。如果用传统的纯化工艺，黄芩苷的得率又得不到保证,进而造成了原药材的大量浪费。壳聚糖作为长链高分子碱性多糖，在稀酸中可形成活性基团-nh3+，对溶液中带负电荷的成分如蛋白质、树胶、鞣质、单宁、部分多糖等［2］进行吸附，从而达到对黄芩水提液净化除杂的作用,在保证产量的前提下实现提高黄芩苷含量的目的。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
lc-20at 型hplc（岛津公司）；88-1型定时恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；中速自动平衡微型离心机（北京医用离心机厂）；zk-82型真空干燥箱（上海市实验仪器总厂）；德国sartorius bs224s电子天平；mettler ae240电子分析天平（瑞士）及实验过程所需的玻璃仪器。
1.2 试剂壳聚糖（济南海得贝生物公司）；甲醇（色谱纯）；双重蒸馏水;其他试剂均为分析纯。
2 方法
2.1 壳聚糖絮凝剂的配制用1%的乙酸为溶剂，分别配制浓度为0.5%,1.0%，1.5%的壳聚糖溶液，充分溶胀后作为絮凝剂，备用。
2.2 黄芩水提液的制备 筛选合格的黄芩干燥根，蒸透后切片。称取黄芩饮片100 g，分别加10倍，8倍量水煎煮2次，1 h/次，纱布过滤，合并两次滤液，平分4份，待用。
2.3 黄芩苷粗品的制备［3］黄芩水提液→加入壳聚糖→静置过夜→离心→上清液水浴加热至40℃→盐酸调ph1.5→40℃恒温1 h→静置过夜→倾去上清液→沉淀水洗至ph 6→减压抽滤→60℃真空干燥→即得。
2.4 单因素实验分别以体系温度、体系ph、搅拌时间、壳聚糖用量以及壳聚糖的浓度为考察因素，在不同水平下进行单因素实验，以期筛选出影响絮凝效果的主要因素和水平。从而为正交实验设计提供依据。
2.5 黄芩苷含量测定方法学考察
2.5.1 色谱条件色谱柱：hypersil ods c18（4.6 mm×250 mm, 5 μm，大连伊利特）；检测器：spd-20 a (shimadzu)；工作站：cs-light；流动相：甲醇－0.4%磷酸水溶液(47 ∶53)；柱温：35℃ ；流速：1 ml/min；检测波长：278 nm。
2.5.2 对照品溶液的制备取黄芩苷1.67 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加少量甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。
2.5.3 供试品的制备称取黄芩苷样品适量，精密称定，置于5 ml量瓶内，加少量甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。
2.5.4 标准曲线的绘制分别取黄芩苷（0.167 mg/ml）标准品溶液2，4，6，8，10，12 μl，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，得到黄芩苷回归方程：y= 565 266.1x+69 456.9，r=0.999 7，说明黄芩苷在0.334 ～2.004 μg范围内线性关系良好。
2.5.5 精密度实验精密吸取同一供试品溶液10 μl，连续进样5次，记录色谱图。测得各共有峰的相对峰面积rsd小于3％，相对保留时间rsd小于1％。表明仪器精密度良好。
2.5.6 稳定性实验取同一供试品溶液，分别于0，2，8，16，24 h测定，记录色谱图。结果表明供试品溶液在24 h内稳定，rsd小于1.5%。
2.5.7 重复性实验取同一样品5份，按供试品溶液制备方法进行制备，分别进样，记录色谱图。测得各共有峰相对峰面积的rsd小于3％，相对保留时间的rsd小于1％。结果表明实验重复性良好。
2.6 正交实验根据单因素实验结果，采用正交试验法优化实验操作条件，选择l9 （3）4正交实验表，分别以ph值（a）、搅拌时间（b）、温度（c）、絮凝剂浓度（d），作为实验因素各设置3个水平，对絮凝条件进行考察。结果见表1。表1 正交实验因素水平（略）
3 结果
3.1 搅拌时间对絮凝作用的影响黄芩水提液在自身ph和60℃条件下，随机取3份黄芩水提液加入1.0%的壳聚糖溶液25 ml后,继续用搅拌器分别搅拌10，30，50 min。再按黄芩苷粗品的工艺流程操作。测其得重依次为：0.967 0，0.847 4， 0.629 7。由测定结果可知，在搅拌10 min后其得重最大。
3.2 体系ph对絮凝作用的影响随机取3份黄芩水提液，体系在60℃条件下分别调节ph至5，6，7。加入1.0%的壳聚糖溶液25 ml并搅拌30 min，再按黄芩苷粗品的工艺流程操作。测其得重依次为：1.374 6，0.674 7，0.313 0 g。由测定结果可知，当体系ph为5即在自身ph条件下其得重最大，但如果体系ph过低会使黄芩苷大量析出，影响粗品黄芩苷重量。
3.3 体系温度对絮凝作用的影响随机取3份黄芩水提液，在自身ph条件下恒温水浴中分别加热至40，50，60℃。加入1.0%的壳聚糖溶液25 ml并搅拌30 min，再按黄芩苷粗品的工艺流程操作。测其得重依次为：0.544 2，0.569 9，0.427 6 g。由测定结果可知，当体系温度在50℃时其得重最大。
3.4 絮凝剂浓度对絮凝作用的影响随机取3份黄芩水提液，在自身ph和60℃条件下分别加入0.5％，1.0％，1.5％的壳聚糖溶液25 ml并搅拌30 min，再按黄芩苷粗品的工艺流程操作。测其得重依次为：1.196 3，0.990 2，0.967 8 g。由测定结果可知，用0.5％的壳聚糖溶液作絮凝剂时其得重最大。
3.5 絮凝剂用量对絮凝作用的影响 随机取3份黄芩水提液，在自身ph和60℃条件下分别加入1.0%的壳聚糖15，25，35 ml并搅拌30 min，再按黄芩苷粗品的工艺流程操作。测其得重依次为：1.177 1，1.091 7，1.090 7 g。由测定结果可知，加入15 ml 1.0%的壳聚糖作絮凝剂时其得重最大。但其得重的变化率低于其他因素得重的变化率，相对于上述4个因素而言，壳聚糖用量对絮凝作用的影响可以忽略，可以不作为主要影响因素考察。
3.6 正交实验结果与分析见表2～3。表2 正交实验结果与分析（略）表3 实验结果方差分析（略）
由表2～3可知，搅拌时间的极差最大，其次是体系ph，故对黄芩水提液絮凝效果影响的大小顺序为b>a>d>c,最佳絮凝条件为a1b1c1d1，即体系ph 5，搅拌时间10 min，体系温度40℃，絮凝剂浓度0.5%。
3.7 最佳方案的验证实验以正交表所得出的最佳絮凝条件为工艺条件，取黄芩饮片25 g，按黄芩苷粗品的工艺流程操作。重复两次。结果见表4。表4 验证实验结果（略）
由表4 可知，采用优化的最佳工艺对黄芩水提液进行除杂后，其黄芩苷得重显著增高，且工艺条件稳定可靠。
4 讨论与结论
实验表明，在保证得率的前提下，壳聚糖对黄芩水提液有较好的絮凝净化作用，而且絮凝作用具有良好的选择性。本实验在综合考虑各种因素的影响后，最终确定了絮凝的最佳工艺条件：体系ph=5，搅拌时间10 min，体系温度40℃，絮凝剂浓度0.5%。本实验在克服传统酸沉法不能兼顾得率与含量的缺点的基础上，采用絮凝法进行除杂，取得良好的预期效果，得重较高，有效地减少有效成分的损失，并且工艺简单，提高了原药料的利用率。
壳聚糖属于一种高分子聚合物，絮凝是通过长碳链上的一些活性官能团，可在同一个分子上吸附多个微粒。因而它在微粒之间产生了联系作用，这种作用称之为架桥作用。由于这种作用，可以将许多微粒连接在一起形成一个絮团［2］。
絮凝是一个复杂的化学动力学过程。搅拌和ph对絮凝效果有显著的影响，原因可能是：当搅拌不充分时，会导致加入的壳聚糖局部浓度过高，使壳聚糖不能及时充分地与微粒相结合，反而被先形成的絮团所包容而沉淀出来，这种沉淀下来的絮团的动力学常数相当稳定，一般的搅拌方式不能有效地一一对其进行完全的破环。这就大大降低了壳聚糖的利用率。同时如果在较低的ph条件下，更有利于壳聚糖分子中的活性基团-nh3+的形成，使絮凝作用进行得更完全。
【参考文献】
1］国家药典委员会．中国药典，ⅰ部［s］.北京：化学工业出版社，2005：211.
［2］董方言．现代实用中药新剂型新技术［m］.北京：人民卫生出版社，2001．
［3］冀春茹.中药化学实验技术与实验［m］.郑州：河南科学技术出版社，1986：273.
