作者：邢立强，赵建清，李旺，孙黎

【摘要】  目的研究瑞香狼毒水提取物对人肺鳞状细胞癌nci-h520细胞株的抑制作用及对survivin表达的影响。方法用不同浓度的瑞香狼毒水提取物处理nci-h520细胞，分别用mtt法检测肺癌细胞抑制率、半定量rt-pcr检测survivin mrna水平以及用western-blotting检测蛋白水平的表达。结果瑞香狼毒水提取物可显著抑制nci-h520细胞的生长，随着药物浓度的升高抑制作用逐渐增强。瑞香狼毒作用4 h后细胞内survivin蛋白的表达水平降低，而survivin mrna的表达变化不明显。结论①瑞香狼毒水提取物可抑制nci-h520细胞的生长，并具有浓度和时间依赖性;②瑞香狼毒水提取物可降低nci-h520细胞的survivin蛋白表达水平，而对mrna水平无明显影响。

【关键词】  瑞香狼毒水提取物; nci-h520细胞株; 生存素

肺癌是当今世界危害人类生命健康最常见的恶性肿瘤之一，发病率呈逐年上升趋势。在发达国家，肺癌居恶性肿瘤发病率及死亡率的第一位[1] ，在肺癌病例中非小细胞肺癌(主要有鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌)占80%左右。wWw.11665.cOm近年来有报道survivin在非小细胞肺癌的表达可引起对化疗药物的耐受，进而影响病人的化疗效果。本研究应用中药瑞香狼毒水提取物作用于人肺鳞状细胞癌细胞株nci-h520，探讨瑞香狼毒对nci-h520生物学行为的影响，旨在为中西药结合治疗人肺鳞状细胞癌，提高患者对化疗药物的敏感性及改善临床治疗效果提供依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 人肺鳞状细胞癌细胞株人肺鳞状细胞癌细胞株nci-h520 购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。

　　1.2 药品与试剂survivin鼠单抗(santa cruz公司产品)、β-actin鼠单抗(美国sigma公司产品)、过氧化物酶标记的羊抗兔二抗、过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗购自北京中杉金桥生物公司;bca蛋白定量试剂盒、western blot ecl显影试剂盒购自武汉博士德公司;医用感光胶片为中国lucky公司产品;trizol试剂和rt-pcr试剂盒均为invitrogen公司产品;瑞香狼毒采自河北北部，提取前经中药专家鉴定确认，水提取物终浓度为5g/ml生药。

　　1.3 细胞培养将nci-h520 细胞复苏后接种至培养瓶。加含有10%胎牛血清和双抗的rpmi 1640培养基5 ml，瓶盖微松，放置37℃，5%co2及饱和湿度的细胞培养箱中，细胞培养至对数生长期。消化、计数，调整细胞浓度至5×104个/ml，将其接种至96孔培养板中。

　　1.4 mtt法检测nci-h520 细胞抑制率将细胞接种至96孔板，每孔100μl;置co2培养箱中继续培养24 h后,于96孔板中依次加入不同浓度的瑞香狼毒水提取物(5，0.5，0.05 g/ml)每一浓度设4个复孔，另设空白组和对照组。继续培养4，8，12，24 h后每孔加入mtt试剂30 μl混匀，置co2培养箱中继续培养4 h后弃上清，每孔加二甲基亚砜100 μl，10 min后用酶标仪在492 nm发射波长下读数，计算细胞抑制率。抑制率的计算：抑制率=1-(od处理组-od空白组/ od对照组-od空白组)。

　　1.5 逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)trizol一步法提取不同浓度瑞香狼毒水提取物作用不同时间的细胞总rna，取1μg总rna用rt-pcr试剂盒进行逆转录，pcr扩增survivin，同时扩增β-actin作为内参。引物由大连宝生物工程公司合成，survivin引物序列为f：5'-ccctgcctggcagccctttc-3' r：5'-ctggctcccagccttcca-3'所扩增片段为188 bp。β-actin引物序列为f：5'-gggaaatcgtgcgtgacatt-3' r：-cggactcgtcatactcctgcttg-3'所扩增片断大小为512 bp。产物经2%的琼脂糖凝胶检测，紫外灯下观察并拍照。

　　1.6 western-blotting检测survivin蛋白的表达收集与药物作用不同时间的细胞，裂解后用bca蛋白定量试剂盒测定各组的总蛋白浓度，各组取总蛋白80 μg经15%sds-page凝胶电泳分离后转移至pvdf膜上，然后用含2%脱脂奶粉的tbs缓冲液室温封闭1 h，洗膜后加入survivin鼠单抗4℃孵育过夜。再洗膜，加过氧化物酶标记的羊抗兔二抗室温孵育1 h，洗膜后ecl显影试剂，暗室曝光。膜经stripping缓冲液处理后重新封闭,用β-actin单克隆抗体进行杂交，过程同上。用灰度扫描仪扫描各组条带，将各组两种蛋白的表达量相比，得出survivin的相对表达量，并以对照组的相对量为1，其它相对量与其相比，得出各组的比值。

　　2 结果

　　2.1 瑞香狼毒对nci-h520细胞的生长抑制作用用mtt法检测瑞香狼毒水提取物处理4，8，12，24 h后的各组细胞毒性分析结果显示，瑞香狼毒对该细胞株有明显的生长抑制作用，浓度越高作用时间越长抑制作用越明显。

　　2.2 瑞香狼毒对nci-h520细胞株survivin mrna表达的影响 将nci-h520细胞株用不同浓度的瑞香狼毒处理4，8，12，24 h后，按trizol试剂盒说明提取总rna，然后用反转录试剂盒把mrna转录成cdna，用survivin和β-actin的引物对各样品的cdna进行扩增，扩增完毕后用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明survivin的表达在mrna水平上无明显改变。

 

　　2.3 瑞香狼毒对nci-h520细胞株survivin蛋白水平表达的影响将nci-h520细胞经瑞香狼毒提取液处理4，8，12，24 h后，用western-blotting检测survivin和β-actin蛋白的表达，经灰度扫描，将各组两种蛋白的表达量相比，得出survivin的相对表达量，并以对照组的相对量为1。其它相对量与之相比，得出各组的相对比值，结果显示，survivin蛋白的表达量在4 h的时候已经开始下降，在8～24 h时进一步降低，而未经药物处理的对照组细胞survivin蛋白的表达量变化不大。

　　3 讨论

　　瑞香狼毒作为中草药应用已有悠久历史，《中国药典》记载其性味苦、平、辛、有毒,入肝、肺、脾三经,有逐水、祛痰、破积、杀虫之功效[2]，并发现其具有明显的抗肿瘤作用。目前由于恶性肿瘤化疗中常用化疗药物的剧烈毒副作用和获得性耐药的出现，严重影响了化疗效果。近年来，中药抗肿瘤逐渐引起人们的重视。国内外学者对瑞香狼毒的抗肿瘤作用进行了大量研究。如对肝癌、肺癌、食管癌、宫颈癌、肉瘤、白血病细胞等[3～5]恶性肿瘤方面影响的研究均有涉足。现有研究多侧重于瑞香狼毒提取物对不同类型肿瘤细胞的抑制率和瑞香狼毒抗肿瘤成分等方面。对瑞香狼毒水提取物抗肿瘤机理的研究较少。

　　survivin是新发现的凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis protein family, iap family)中的新成员，与细胞分裂、增殖等功能密切相关。survivin在胚胎组织和大多数肿瘤组织中高表达，而在正常的终末分化组织和癌旁组织沉默[6]，提示此蛋白可能与肿瘤的发生有密切关系。survivin的过表达几乎出现在所有早期非小细胞肺癌病人，因此, survivin的过表达可作为肺癌早期诊断的一个参考性指标，具有早期诊断价值[7]。survivin的表达状况与患者的年龄、性别、病理组织学之间无关，而与分期有关，分期越晚其阳性率越高[8]，又可作为判断肺癌病人预后的指标[9]。研究还表明，单独封闭survivin基因可充分介导细胞凋亡，具有较好的靶向特异性，有望成为抗肿瘤治疗的一个新途径。

　　非小细胞肺癌包括腺癌、鳞状细胞癌、大细胞未分化癌等类型，约占肺癌患者总数的80%。本研究选择人肺鳞状细胞癌nci-h520细胞株，探讨给予瑞香狼毒处理后细胞的生长抑制及凋亡抑制蛋白survivin的表达及其mrna转录水平。结果显示：瑞香狼毒水提取物对nci-h520细胞株具有明显的抑制作用。这与我们以往的研究结果一致[10]，也为许多学者的研究所证实。研究结果还发现瑞香狼毒水提取物对survivin的表达具有明显抑制作用，并具有浓度和时间依赖性。而survivin mrna的转录水平变化不明显。由此可见，瑞香狼毒对肺癌细胞nci-h520的抑制作用一部分可能是通过抑制凋亡抑制蛋白survivin的表达而实现的。survivin mrna的转录水平变化不明显说明瑞香狼毒抑制survivin的表达不是通过影响survivin基因的从头合成产生的。只是特异性地作用于survivin的转录后调节或翻译过程而抑制survivin的表达水平。可能肿瘤组织中的某些基因或其表达产物对survivin的表达起到开关作用。如果找到survivin表达的控制机制将为提高肺癌的化疗效果起到重要的推动作用。本研究证实瑞香狼毒提取物可抑制凋亡抑制蛋白survivin的表达，它或许对临床某些耐药病例的化疗起到增效作用，将为中西药治疗肺癌开辟新的治疗途径。由于肺癌耐药机制非常复杂，具体对哪些病例和哪些治疗方案起到增效作用还有待进一步证实。

　　综上所述，瑞香狼毒可通过抑制肺癌细胞中survivin的表达诱导细胞的凋亡，而这种表达的抑制不是通过影响survivin基因的从头合成产生的。可能是作用于survivin的转录后调节或翻译过程而抑制survivin的表达水平。survivin作为抑制凋亡蛋白家族成员其与肺癌细胞的耐药有密切关系。因此，本结果提示瑞香狼毒降低survivin的表达，可能对肺癌细胞的耐药具有抑制作用。可增加肺癌对化疗药物作用的敏感性，增强肺癌化疗效果。

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　　[9] fan j, wang l, jiang gn, et al.the role of survivin on overall survival of non-small cell lung cancer, a meta-analysis of published literatures[j]. lung cancer，2008 ：11.

　　[10] 邢立强，李 旺，李鸿君，等.瑞香狼毒提取物对肺癌细胞超微结构的影响[j]. 时珍国医国药，2007，18(8)：1844.