作者：欧阳瑾，曹志友，王爽，雷钧涛

【摘要】  　　目的观察白桃汤剂对c57bl/6小鼠体内lewis肺癌生长、血管生成及转移的影响。方法复制c57bl/6小鼠lewis肺癌模型，随机分为4组，分别给予生理盐水，白桃汤低剂量，高剂量，环磷酰胺(ctx)治疗，观察肿瘤生长，运用免疫组化方法对移植瘤中血管内皮细胞生长因子(vegf)和微血管密度(mvd)的表达及转移发生率等指标进行检测和分析。结果白桃汤剂低、高剂量组vegf的表达率分别为54.6%、48.7%；mvd分别（27.26±3.39），（22.85±3.23）；瘤重分别为（2.66±0.46）g,(2.22±0.36) g；抑瘤率分别为35.4%,46.2%。生理盐水组vegf的表达率为79.5%，mvd为（46.18±5.21），经统计学处理有显著性差异(p<0.05)，vegf高表达率与mvd的关系经直线相关分析，呈显著正相关。结论白桃汤剂可以降低移植瘤mvd与vegf的高表达率，vegf表达率与mvd呈正相关。白桃汤剂对鼠lewis肺癌的血管生成、生长和转移有明显的抑制作用。

【关键词】  白桃汤剂； 肺肿瘤； 血管内皮生长因子； 微血管密度； 小鼠

　　白桃汤剂为民间祖传秘方，曾为不少病人解除过病痛。wWW.11665.com目前研究中药抗肿瘤治疗已成为热点之一，本实验观察白桃汤剂治疗对lewis肺癌小鼠血管密度(mvd)及血管内皮细胞生长子(vegf)的影响，从肿瘤血管生成的角度探讨白桃汤剂的抑瘤效应及其机制，旨在为该药在临床上的进一步应用提供科学依据。

　　1  材料
   
　　lewis肿瘤细胞株(购于中科院上海细胞库)。健康c57bl/6纯系小鼠雌雄各半，体质量(19±2)g（购于吉林省长春市生物制品研究所）。白桃汤剂方由核桃皮15 g，白附子15 g，甘草10 g，黄芪20 g等组成（吉林医药学院自制），按常规方法制成1 g/ml保存备用。第vⅲ因子(f8)单克降抗体，血管内皮细胞生长因子(vegf)抗体及sp免疫组化试剂盒（均购于福州迈新生物技术开发公司）。环磷酰胺(ctx)0.2 g/支（上海华联公司产品，批号:01014）。

　　2  方法

　　2.1  接种液准备将小鼠lewis肺癌细胞置于含10%胎牛血清及dmem的完全培养液中，在37℃，5%co2培养箱中培养，2～3 d更换1次培养液，0.25%胰蛋白酶消化传代。细胞总数达到要求后，台盼蓝拒染法测定活细胞数＞95%，调节细胞浓度为5×106 ml-1的细胞悬液备用。

　　2.2  造模取40只小鼠，雌雄各半，体质量（18±1）g，于腋后线第6肋间胸腔接种，每只接种0.2 ml，细胞计数为5×106 个细胞/ml。建立小鼠肿瘤动物模型。

　　2.3  分组造模2d后随机分成4组，每组10只。生理盐水组(a组)：给予生理盐水0.2ml灌胃，1次/d；白桃汤剂低剂量组(b组)：0.2ml药液灌胃（相当于40 ㎎/㎏），1次/d；白桃汤剂高剂量组(c组)：0.6ml药液灌胃（相当于120 ㎎/㎏），1次/d；环磷酰胺(ctx)组(d组),用量（60 ㎎/㎏）腹腔注射，1次/d，同时以生理盐水0.2 ml灌胃。各组均连续给药15d。第17天处死全部小鼠进行指标检测。

　　2.4  观察项目

　　2.4.1  瘤体积、瘤重用游标卡尺测量瘤体长径和短径，计算瘤体积，瘤体积=0.5ab2 (a-长径,b-短径)绘制增殖曲线。肿瘤抑制率=(生理盐水组平均瘤重-给药组平均瘤重)/生理盐水组平均瘤重×100%。

　　2.4.2  肿瘤组织微血管密度(mvd)检测完整剥离肿瘤组织，10％甲醛固定，24 h后石蜡包埋，切成厚4 μm的切片，常规方法脱蜡脱水，pbs漂洗，兔抗鼠vⅲ因子单克隆抗体(丹麦dako公司)4℃孵育过夜，pbs漂洗后加二抗，室温30 min，pbs漂洗后dab显色，苏木精衬染。按试剂盒操作说明进行免疫组织化学染色，肿瘤区域内任何呈棕黄色染色的单个或多个内皮细胞、与周围肿瘤细胞及间质细胞有明确分界者计数为1个微血管，先于低倍镜(100×)下确定切片中肿瘤血管最密集、染色最强的区域，在此区域内显微镜下记数20个视野肿瘤微血管数目，以平均每高倍镜(200×)视野微血管个数表示mvd［1］。

　　2.4.3  血管内皮细胞生长因子(vegf)免疫组化染色及阳性表达结果的判定vegf免疫组化染色采用sp法。以pbs代替一抗作为阴性对照，以已知vegf阳性的乳腺癌作为阳性对照。阳性表达结果判定采用半定量记分法，即每张组织切片染色强度：阴性0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，深棕黄色为3分。阳性细胞比例：o％ 为0分；≤25％为1分，26％～50％为2分；>50％为3分。两项打分相加≥2分为vegf染色阳性(+)，≥4为（++），≥6（+++）［2］。

　　2.5  统计学处理采用spss10．0统计软件进行统计处理，mvd的组间比较采用t检验，vegf阳性率的组间比较采用卡方检验。

　　3  结果

　　3.1  肿瘤生长曲线治疗后生理盐水组裸鼠肿瘤生长迅速，另三组肿瘤生长明显减慢，部分肿瘤停止生长，少数肿瘤缩小，但未出现肿瘤消退。治疗到第15天时移植瘤体积：a组 (1260.1±476.9) mm3 ，b组(193.2±101.6) mm3 ，c组(138.0±69.5) mm3，d组(86.3±3.7) mm3。d组瘤体积明显小于白桃汤剂(c、d)治疗组(p<0.05)和a组(p<0.01)。到第17天时体积见表1。表1  各治疗组对肿瘤的抑制作用（略）
   
　　不同浓度的白桃汤剂和ctx作用于荷瘤c57bl鼠产生的影响均呈现明显的时间-效应关系。a组肿瘤平均直径明显大于各实验组。

　　3.2  抑瘤率从表1可以看出，b、c、d组的移植瘤体积、瘤重均明显小于a组。b，c组与a组比较经统计学分析有显著性差异(p<0.05)，表明白桃汤剂有与环磷酸胺相似的抑瘤效果，且效果明显。

　　3.3  抗肿瘤转移作用统计各组的肺转移数目得到结果见表2，差异有统计学意义(p=0.0316)。表2  各组肿瘤组织的vegf个（略）

　　3.4  对vegf和mvd的影响白桃汤剂对肿瘤组织mvd和vegf染色的影响  b、c、d组mvd及vegf均低于a组，有统计学意义（p<0.05），见表3。说明低、高剂量的白桃汤剂均能降低肿瘤mvd及vegf的表达，具有抑制肿瘤血管生成及转移的作用。表3  各组对肿瘤mvd及vegf的影响（略）

　　4  讨论
   
　　血管生成是肿瘤浸润生长与转移的一个重要前提。实体肿瘤的生长和代谢需要持续的血管生长来支持，血管生成是肿瘤生长和代谢必备的条件，也是肿瘤细胞转移的基础［3］。大量研究证实，缺少新生血管的肿瘤往往被限制在很小的范围内，体积仅为1～2 mm3［4］，血管内皮细胞黏附并向肿瘤移行是肿瘤血管生成的重要步骤之一，vegf，b-fgf，mmp等多种促血管生成物质，可以引起内皮细胞迁移，并通过向肿瘤组织内移行，实现肿瘤的血管生成［1］。因此，抑制血管生成在肿瘤治疗领域中有广阔的前景。抗肿瘤血管生成疗法成为近年来抗肿瘤治疗研究的热点之一。
   
　　肿瘤的转移过程极其复杂，包括多个步骤。可被形象地称为多阶梯瀑布过程，而血管生成贯穿着肿瘤转移的大部分过程。研究已证实，实体瘤的生长、扩散和转移均依赖于肿瘤血管生成，若能阻断该过程，则能使肿瘤处于休眠状态，亦即“肿瘤良性化”，故抑制血管生成对肿瘤转移的抑制有着极为重要的意义。血管内皮细胞生长因子(vegf)是迄今鉴定出来可溶性的作用最强，特异性最高的参与微血管生成的主要正向调节因子［5］。vegf是一种多肽类的细胞因子，具有双重的生理功能 ：一是促进血管内皮细胞分裂增殖和化学趋化性；二是提高血管尤其是微血管通透性，使血浆蛋白从高渗透性的血管中外凝固，改变细胞外基质，该基质最终将降解并转化成胶原结缔组织，为肿瘤侵袭和转移提供适合的基础，与肿瘤的生长和转移密切相关［6］，降低vegf的表达则能起到抑制肿瘤血管生成的作用。微血管密度(mvd)可反映肿瘤的血管生成情况，目前其判断预后，筛选高危复发或转移患者的重大价值得到了广泛肯定。大量报告证实vegf与mvd呈高度正相关，提示mvd可一定程度上解释vegf抗转移复发功能的机制 。
   
　　本研究表明，白桃汤剂对鼠lewis肺癌的血管生成、生长和转移有明显的抑制作用，能明显降低lewis肺癌血管内皮细胞生长因子(vegf)的高表达率和微血管密度(mvd)，同时vegf蛋白表达与微血管生成具有一致性，经统计学分析认为vegf和mvd之间呈高度正相关，提示其抑瘤的作用机理可能与下调mvd,vegf的表达有关。作用机制可能是通过杀伤内皮细胞、抑制血管生成而起到抗肿瘤生长的作用。该研究结果与目前国内外多数学者的研究结论相符，即通过抑制形成血管的内皮细胞迁移来达到抑制新生血管的生成［7］。提示通过调节vegf表达，进而降低mvd，是白桃汤抑制肿瘤细胞生成和转移的主要机理之一。

【参考文献】
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　　［2］丁荣杰，唐德才．三棱、莪术对移植性肝癌大鼠vegf的影响［j］．中华实用中西医杂志.2005，18(18)：1047.

　　［3］shibuya m. angiogenesis，anti-angiogenesis，and tumor suppres-sion［j］． nippon yakurigaku zasshi，2002,120(5):285.

　　［4］folkman j．can mosaic tumor vessels facilitate molecular diagnosis of cancer? ［j］.proc natl acad sci u s a，2001，98(2):398.

　　［5］王慧敏，廖美琳．血管内皮生长因子对非小细胞肺癌术后生存率的影响［j］．中国癌症杂志，2000，10(4)：299.

　　［6］曾民德，王泰龄，王宝恩．肝纤维化诊断及疗效评估共识［j］．中华肝脏病杂志，2002，10(5)：327.

　　［7］judah folkman．anti-angiogenesis in cancer therapy-endo-statin and its mechanisms of action［j］. exp cell res,2006，212（2）：594.