作者：肖瑛，石明隽，桂华珍，郭兵，张国忠
【摘要】 目的观察丹芪合剂和依那普利对糖尿病（dm）大鼠肾小管上皮细胞骨形态发生蛋白-7（bmp-7）及其受体alk-3表达的影响，探讨丹芪合剂的药理机制。方法将sd大鼠分为正常对照组（a组）、糖尿病组（b组）、糖尿病丹芪合剂组（c组）和糖尿病依那普利组（d组）。以链脲佐菌素复制dm大鼠模型。于实验12周处死大鼠后测定相应生化指标和肾脏指数，pas染色观察肾组织的形态结构变化；免疫组化检测肾小管上皮细胞bmp-7和fn蛋白的表达；rt-pcr方法检测肾皮质bmp-7和alk-3 mrna水平。结果①b组的血糖、甘油三酯和总胆固醇、血肌酐、肾脏指数均显著高于a组并出现明显的蛋白尿，c和d组上述指标除血糖外均明显低于b组。②免疫组化结果显示bmp-7蛋白高表达于a组肾小管上皮细胞胞浆，fn仅有少量表达；b组bmp-7蛋白的表达明显减少，fn表达却明显增多；c和d组肾小管上皮细胞bmp-7蛋白表达显著高于b组，但低于a组，同时fn的表达减少。③rt-pcr结果显示，与a组相比，b组肾皮质bmp-7表达明显减少，且alk-3 mrna未见表达，c和d组bmp-7及其受体alk-3 mrna表达均显著高于b组，d组alk-3 mrna表达甚至高于a组。wWw.11665.COM结论丹芪合剂和依那普利可能通过促进内源性bmp-7及其受体alk-3的表达,使fn的沉积减少,从而对糖尿病大鼠肾脏起保护作用。
【关键词】 糖尿病肾病； 骨形态发生蛋白-7； alk-3； 丹芪合剂； 依那普利
abstract：objectiveto investigate the effects of dan qi mixture and enalapril on the expression of bone morphogenetic protein-7(bmp-7) and its receptor alk-3 in the renal tubules of diabetic rats. methods sd rats were randomly divided into normal control group (group a), diabetic group (group b), diabetic danqi-treated group (group c), diabetic enalapril-treated group (group d). the diabetic rat model was made with streptozotocin .after 12 weeks, blood glucose, triglyceride, cholesterol and creatinine, urine protein were analyzed with biochemical methods. kidney index was analyzed as well. the changes of pathomorphology were examined in pas staining sections. immunohistochemistry was employed to detect the expression of bmp-7 and fn protein in renal tubules of all groups. the mrna levels of bmp-7 and its receptor alk-3 in renal cortex were examined by rt-pcr. results①compared with group a, the levels of blood glucose, triglyceride, cholesterol and creatinine, urine protein and kidney index were increased remarkably in group b. in group c and d, parameters above-mentioned except blood glucose were notably cut down. ② the expression of bmp-7 protein was high and fn protein was slight by immunohistochemistry in group a. on the other hand, the protein of bmp-7 was decreased remarkably in group b, and the protein of fn was increased. in group c and d, the expression of bmp-7 protein was up-regulated notably, but the protein of fn was decreased. ③ compared with group a, the expression of bmp-7 mrna and its receptor alk-3 decreased remarkably by rt-pcr in group b. in group c and d, the expression of the bmp-7 and alk-3 mrna was up-regulated notably compared to group b, and the expression of alk-3 mrna in group d was even higher than that in group a . conclusionthe danqi mixture and enalapril can promote the expression of endogenous bmp-7 and its receptor alk-3 in the renal tubule cells, and therefore reducts the deposition of fn and protects the kidney of diabetic rats.
key words： diabetic nephropathy； bmp-7； alk-3； danqi mixture； enalapril
糖尿病肾病是导致终末期肾衰竭的常见原因，目前尚无有效的治疗药物。有研究表明骨形态发生蛋白-7（bone morphogenetic protein-7，bmp-7）治疗可部分逆转糖尿病动物肾脏肥大，并且其减轻蛋白尿和恢复肾小球滤过率的作用甚至优于血管紧张素转换酶抑制剂依那普利的治疗效果［1］。本课题组以往的研究表明,具活血化瘀和益气养阴功效的丹芪合剂能减轻糖尿病肾脏的病变，改善肾功能［2］，但其作用机制未明。本研究旨在观察丹芪合剂是否通过调节bmp-7及其受体alk-3的表达来发挥其对肾脏的保护作用，以进一步了解该药物的作用机制。
1 材料
1.1 动物24只雄性sd大鼠，体质量174～204g，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司［scxk(沪) 2003-0002］。
1.2 药物和试剂链脲佐菌素(streptozotocin，stz，美国sigma）；依那普利(扬子江制药厂)。丹芪合剂为丹参、黄芪等中药提取物干粉，自制。血糖、甘油三酯、总胆固醇、肌酐和尿蛋白检测试剂盒(迈克科技有限公司)。山羊抗大鼠bmp-7多克隆抗体(santa cruz)，兔抗大鼠fn多克隆抗体和生物素化山羊抗兔igg (武汉boster公司), ultra sensitivetmsp超敏试剂盒（kit-9709/9719）和dab显色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）；revert aidtm first strand cdna synthesis kit（fermentas）；taq pcr mastermix，d2000（北京tiangen生物技术有限公司）。
2 方法
2.1 糖尿病模型的制备大鼠尾静脉注射溶于ph 4.5，0.01 mol/l的无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的链脲佐菌素,剂量为50mg/kg，正常对照组于尾静脉注射stz溶媒；注射后48 h尾静脉采血测血糖(baer公司 glucometer 4 型血糖仪) ,凡血糖值大于或等于16.7 mmol/ l的大鼠作为糖尿病大鼠。
2.2 分组分为正常对照组(a组) 、糖尿病组(b组) 、糖尿病丹芪合剂组(c组), 按2 g·kg -1·d -1给药和糖尿病依那普利组(d组), 按10 mg·kg - 1·d - 1给药，各组均为6只。喂以普通饲料,自由饮水。
2.3 血、尿及肾组织采集于实验12周处死各组大鼠，处死前代谢笼收集24 h尿；心脏穿刺采血；肾脏经反复灌洗后,称重,一侧肾脏置-80℃冰箱保存供rt-pcr检测用,另一侧肾脏用4%多聚甲醛固定,供石蜡切片用。
2.4 免疫组织化学3 μm厚肾组织石蜡切片，微波修复抗原，采用sp法检测bmp-7和sabc法检测fn，以pbs作阴性对照，dab染色。bmp-7在高倍镜（400×）下计数10个视野的阳性肾小管数，取均值；fn在显微镜测微尺（0.5网形目镜尺）下计数十字交叉点与fn阳性染色表达重合的点数，计数十个视野（400×），取均值。
2.5 rt-pcr引物委托上海generay biotech公司合成，bmp-7：上游5'- gcacctccagggaaaac- 3'，下游：5'- aagcccagatggtacgg - 3'，扩增产物为451 bp；alk-3：上游5'-agatggctcgtcgttgtatcac-3'，下游5'-gagtctggaggctggattgtg-3'，扩增产物为217 bp；β-actin：上游5'-gaaatcgtgcgtgacattaag-3'，下游5'-ctagaagcatttgcg gtgga-3'，扩增产物为490 bp。用trizol试剂提取总rna，核酸蛋白分析仪检测含量。1 μg总rna以oligo(dt)18primer为反转录引物，合成cdna，以cdna为模板按逆转录试剂盒方法进行rt-pcr。pcr反应参数根据各不同目的片段进行最优化，最后将扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶电泳，应用凝胶成像系统进行扫描并用chmiodox软件分析图像，pcr产物量以吸光度×面积表示，与β-actin比值表示目的基因的相对含量。
2.6 用氧化酶法测血糖chod-pap法测总胆固醇，gpo-pod法测甘油三酯，不去蛋白终点法测血肌酐，考马斯亮蓝法测尿蛋白，按试剂盒说明书操作。
2.7 统计学分析实验数据以 ±s表示，采用spss11.5软件处理，组间数据差异比较采用方差齐性检验，用one-way anova分析；p＜0.05表示差异有显著性。
3 结果
3.1 各组生化指标及肾脏指数的变化糖尿病组的血糖、甘油三酯和总胆固醇、血肌酐及肾脏指数均显著高于正常对照组（p< 0.01或p< 0.05），出现明显的尿蛋白（p< 0.01）；丹芪合剂和依那普利组与糖尿病组比较，除血糖外，甘油三酯和总胆固醇、血肌酐及肾脏指数均明显下降，有显著性差异（p< 0.01），但丹芪合剂和依那普利组之间无显著性差异。结果见表1。表1 各组大鼠血糖、甘油三酯和总胆固醇、scr 、24 h 尿蛋白和肾脏指数的变化（略）
3.2 肾组织形态学变化pas染色显示糖尿病组大鼠部分肾小管腔扩张，肾小管上皮细胞空泡变性,细胞萎缩和脱落，伴pas染色阳性物质沉积增多；而丹芪合剂和依那普利治疗组病变较糖尿病组大鼠相对较轻。结果见图1。
3.3 丹芪合剂和依那普利对bmp-7和fn蛋白表达的影响免疫组化结果显示正常对照组bmp-7蛋白高表达于集合管和肾小管胞浆，肾间质及肾血管外膜也有少量表达，但肾小球未见阳性表达；fn沿肾小管基膜呈线性表达；糖尿病组大鼠肾组织bmp-7的表达明显低于正常对照组，而fn蛋白的表达明显增多。丹芪合剂和依那普利治疗组，肾小管bmp-7蛋白的表达高于糖尿病组，差异有统计学意义。同时fn蛋白的表达丹芪合剂和依那普利治疗组明显低于糖尿病组。结果见表2和图2～3。表2 各组bmp-7和fn蛋白的表达（略）
3.4 丹芪合剂和依那普利对bmp-7和alk-3 mrna表达的影响正常对照组bmp-7及其受体alk-3 mrna呈高表达；与正常对照组相比，糖尿病组肾皮质bmp-7 mrna表达明显减少，alk-3 mrna未见表达；丹芪合剂和依那普利治疗组bmp-7及其受体alk-3 mrna的表达均显著上调，但两组之间bmp-7 mrna表达无显著性差异，而依那普利组alk-3 mrna的表达不但高于丹芪合剂组，甚至还高于正常对照组。结果见图4。
4 讨论
近年研究发现，bmp-7属转化生长因子-β(tgf-β)超家族成员之一，不但是一种肾脏形态发育过程中必需的、具有独特的恢复和维持上皮细胞表型等作用的细胞因子，而且还是一种可延缓慢性肾小管间质纤维化发展的一个重要的肾脏保护因子［3］。在糖尿病肾病等多种慢性肾脏病动物模型中，bmp-7表达减少或缺失，而给予一定剂量的外源性bmp-7可延缓甚至逆转已发生的肾脏损伤，其减轻蛋白尿的作用与依那普利治疗组相似［4，5］。丹芪合剂是从生芪消渴胶囊（国药准字b20020264）衍化的制剂，由丹参、黄芪、生地黄等中药提取物组成，具有益气生津、活血化瘀的功效。本课题组以往的研究表明［6］，丹芪合剂可抑制糖尿病肾病大鼠肾小球丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, mapk)、蛋白激酶cα（pkcα）和tgf-β1的表达及使细胞外基质（ecm）的主要成分fn沉积减少，肾脏肥大程度减轻，改善肾功能，延缓dn的发展。但这种保护机制是否与调节内源性bmp-7的生物学活性有关有待证实。本实验显示bmp-7及其受体alk-3高表达于正常对照组大鼠肾脏集合管、远曲小管等，糖尿病组二者的表达均明显降低，fn的表达显著增多；而用丹芪合剂治疗后，bmp-7及其受体alk-3的表达被显著上调，fn的表达被下调，同时除血糖外，其它生化指标均明显下降，肾脏的病理改变减轻，这表明丹芪合剂可能通过增加bmp-7及其受体alk-3的表达进而改善肾小管间质的损害，这与wang s 等［5］用外源性bmp-7治疗的研究结果一致，提示丹芪合剂可能有促进内源性bmp-7表达上调的功效。另有研究表明［7］在uuo大鼠血管紧张素转化酶抑制剂依那普利可通过上调bmp-7及其受体的表达，增强bmp-7保护梗阻性肾病的生物学活性，从而达到抑制tgf-β1的促纤维化作用，所以我们同时观察了依那普利治疗组，发现该组bmp-7及其受体alk-3 mrna的表达均显著上调，且alk-3 mrna的表达甚至高于正常对照组，提示依那普利也可能是通过上调bmp-7及其受体alk-3的表达，尤其是促进了alk-3的增多，导致bmp-7受体复合物生成增多而发挥肾脏保护作用。
比较中西药物治疗组，发现丹芪合剂组与依那普利组bmp-7蛋白的表达之间无显著性差异，糖尿病组alk-3 mrna未见表达，而治疗组显著增多，且依那普利较丹芪合剂促进受体alk-3 mrna水平增多的作用似更明显，提示两种药物可能通过上调bmp-7和alk-3基因水平，而促进其蛋白的表达，进而抑制fn的分泌，促进组织形态学恢复，改善肾功能，提高存活率。这与其他作者［8，9］在人肾小管上皮细胞中研究发现，给予高浓度的bmp-7可直接或间接减少tgf-β1诱导的ⅳ型胶原和fn的沉积的结果相一致。
综上所述，促进内源性bmp-7的表达为防治糖尿病肾病等肾脏疾病提供了一个可能途径，而自拟中药——丹芪合剂可能具有通过促进内源性bmp-7及其受体alk-3的表达而发挥其延缓或阻断糖尿病肾小管间质纤维化发生发展的作用。
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