作者：叶国荣，舒建昌，何雅军，吕霞
【摘要】 目的 观察四氯化碳腹腔注射制作大鼠肝纤维化模型时相关细胞因子的变化，初步探讨四氯化碳腹腔注射致大鼠肝纤维化的机理。方法 以四氯化碳腹腔注射的方法[四氯化碳0.025 ml (用花生油1∶6稀释)/次，每周3次，共14周]制作大鼠肝纤维化模型，设立正常、溶剂对照组，检测血清丙氨酸氨基转移酶(alt)、天门冬氨酸氨基转移酶(ast)、透明质酸(ha)、层黏连蛋白(ln)、ⅲ型前胶原(pcⅲ)含量;elisa法检测转化生因子β1(tgfβ1)、肿瘤坏死因子(tnfα);化学法检测血清氧化亚氮(no)。肝组织行he和masson胶原染色，光镜下观察病 理学 改变，并按sss计分系统进行评分。免疫组化染色观察肝组织血小板源生长因子bb(pdgfbb)的变化，专业图像分析软件进行图像分析。结果 与正常对照组、溶剂对照组比较，模型组血清alt、ast、ha、ln、pcⅲ、no、tgfβ1 、tnfα明显升高(p<0.05)，大鼠肝组织肝纤维化评分明显升高(p<0.05)，肝组织pdgfbb表达明显增多(p<0.05)。www.11665.cOM结论 促进相关细胞因子的表达可能是四氯化碳腹腔注射致大鼠肝纤维化的机理之一。
【关键词】 四氯化碳;肝纤维化;细胞因子
abstract:objective to investigate the variation of correlated cytokine when the rat models of hepatic fibrosis were induced by intraperitoneal injection of carbon tetrachloride,and to the relevant molecular mechanism. methods rat models of hepatic fibrosis were made by intraperitoneal injection of carbon tetrachloride at 0.025 ml(diluted 1∶6 with peanut oil),three times a week,a total of 14 weeks. the normal and dissolvent groups were prepared as controls. serum levels of alt,ast,ha,ln,pcⅲ were detected; serum levels of tgfβ1 and tnfα were detected by elisa method. serum levels of no were detected by chemical method. he and masson staining were conducted in hepatic tissues to observe pathological variations. grades of hepatic fibrosis were evaluated according to semiquantitative histological scoring system (sss system). immunohistochemical staining was executed for detecting pdgfbb in liver,and professional software for image analysis was used. results carbon tetrachloride could increase obviously serum levels of alt,ast,ha,ln,and pcⅲ (p<0.05),which were higher than the normaland dissolvent groups. the score of hepatic fibrosis in the model group increased significantly (p<0.05). carbon tetrachloride could increase the expression of pdgfbb (p<0.05). conclusion the correlated cytokines was increased when the rat models of hepatic fibrosis were induced by intraperitoneal injection of carbon tetrachloride. increasing the expression of correlated cytokines may be one of the molecular mechanisms of hepatic fibrosis in rat models induced by intraperitoneal injection of carbon tetrachloride.
key words:carbon tetrachloride; hepatic fibrosis; cytokine
肝纤维化(hepatic fibrosis)是肝脏对各种慢性损伤的一种修复反应，其特征是以胶原为主的细胞外基质(extracellular matrix,ecm)在肝内过多沉积。在肝纤维化的发生 发展 过程中，一系列的细胞因子被激活，在疾病的进程中发挥重要的作用。常见的细胞因子有转化生因子β(tgfβ)、血小板源生长因子(pdgf)、肿瘤坏死因子(tnfα)、表皮生长因子(egf)与ros(过氧化氢、超氧游离基)等。研究表明，相关细胞因子的表达，可以引起肝星状细胞(hepatic stellate cell，hsc)活化，促进肝纤维化的发生发展[1]。
四氯化碳(ccl4)腹腔注射是制作肝纤维化模型的经典方法，在前期的系列研究中曾多次采用该方法成功地建立大鼠肝纤维化模型[2-8]，但有关其作用机制尚未阐明。既往的研究大多数为观察四氯化碳腹腔注射造模的效果，国内少有对其作用机理方面的研究报告。本研究拟观察ccl4制作肝纤维化模型时相关细胞因子的变化，初步探讨ccl4腹腔注射致大鼠肝纤维化的机理。
1 实验材料
1.1 主要药物、试剂
ccl4，分析纯，天津市北宏试剂厂生产;食用花生油;羧甲基纤维素钠，广州器化医疗设备有限公司进口分装;alt、ast试剂盒，北京中生北控生物科技股份有限公司生产;ha、ln 、pcⅲ放射免疫分析试剂盒，上海海岩医学生物技术中心生产;苏木素、伊红购自美国sigma公司;masson三色胶原试剂盒及即用型sp超敏试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司;no试剂盒购自南京建成生物工程研究所;大鼠tgfβ1、tnfα elisa试剂盒及兔抗大鼠pdgfbb多克隆抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.2 动物及实验环境
spf级sd大鼠，雄性，体质量180～230 g，由广州中医药大学实验动物中心提供[合格证号：scxk(粤)20030001，粤监证字2005a031]。于广东省药物研究所标准spf实验室(粤监证字2005c125号)进行动物饲养及实验。
2 方法
2.1 肝纤维化模型的建立
腹腔注射ccl4 0.025 ml (用花生油1∶6稀释)，每周3次，共14周。
2.2 动物分组与处理
30只sd大鼠随机分为模型组、正常对照组、溶剂对照组，每组各10只。模型组予腹腔注射ccl4 0.025 ml (用花生油1∶6稀释)，每周3次，共14周;正常组不予处理;溶剂对照组予腹腔注射花生油(0.15 ml/只/次)，每周3次。
2.3 观察项目与方法
14周动物实验结束后，采用股静脉放血法最大量取血，分离血清，-20℃保存待检;留取部分肝组织于4%(φ)中性甲醛溶液固定，部分于-170 ℃液氮中保存待检。
自动生化分析仪检测血清alt、ast、ha、ln、pcⅲ，血清no检测参照试剂盒进行，放射免疫方法检测tgfβ1、tnfα;肝组织按常规方法行he染色，参照试剂盒方法行masson三色胶原染色，光镜下观察肝脏的病理改变，并按照肝纤维化半定量计分系统(sss)方法，对各组大鼠肝纤维化程度评分，得分越高，表示纤维化程度越重，最高29分，最低0分[2]。sp免疫组化法检测肝组织pdgfbb，采用专业显微图像分析软件(axiovision，4.5版，germany)进行图像分析。
2.4 统计方法
数据采用(±s)表示，用spss 12.0统计软件进行统计学处理，多组数据间比较采用单因素方差分析(oneway anova)，进行方差齐性检验，若各组总体方差齐同，采用tukey(n>5)检验;若各组总体方差不齐同，采用tamhanes t2检验。p<0.05为差异有显著性。
3 结果
3.1 肝功能指标及血清no 与正常对照组、溶剂对照组比较，模型组大鼠血清中alt、ast活性及no含量明显升高(p<0.01) ;正常组与溶剂组比较，差异无显著性(p>0.05)，见表1。
3.2 血清肝纤维化指标 与正常对照组、溶剂对照组比较，模型组血清中ha、ln、pcⅲ明显升高 (p<0.01) ;正常组与溶剂组比较，差异无显著性(p>0.05)(见表1)。表1 各组大鼠血清alt、ast、ha、ln、pcⅲ及no含量的比较
与正常对照组、溶剂对照组比较:﹟p <0.01
3.3 血清tgfβ1、tnfα 与正常对照组、溶剂对照组比较，模型组血清tgfβ1、tnfα水平明显升高，差异有显著性(p<0.01);正常组与溶剂组比较，差异无显著性(p>0.05)。(见表2)。表2 各组大鼠血清tgfβ1、tnfα的比较
与正常对照组、溶剂对照组比较:﹟p <0.013.4 肝组织病理 he染色见正常组与溶剂组肝小叶结构完整，肝索排列整齐，无炎症细胞浸润;模型组肝小叶结构被破坏，肝索排列紊乱，有炎症细胞浸润，肝细胞水肿、脂肪变性明显，部分可见假小叶形成，证实肝纤维化形成，造模成功。
masson三色胶原染色示：正常组与溶剂组仅在汇管区有极少量胶原纤维存在，肝小叶间未见纤维组织增生，无假小叶形成;模型组见汇管区大量胶原纤维增生，增生的胶原纤维形成纤维分隔，破坏肝小叶结构，分割、包绕肝小叶，有假小叶形成。
综合he及masson染色的镜下表现，按照肝纤维化半定量评分方法，进行单盲读片并予以评分。各组得分结果见表3。结果显示：正常组、溶剂组得分差异无显著性(p>0.05);模型组肝纤维化评分明显升高(与正常组、溶剂组比较，p<0.01)。
3.5 肝组织pdgfbb免疫组化染色 棕黄色颗粒位于阳性细胞的胞浆，阴性对照片背景洁净，无非特异性染色，阳性对照片可见阳性表达。肝组织pdgfbb表达，主要分布在门静脉、汇管区及纤维间隔等纤维化区。与正常组比较，模型组阳性染色所占面积比例明显升高(p<0.01),见表3。表3 肝组织病理检测结果
4 讨论
no是局部化学介质，是近年来逐渐被认识的气相信息分子。李隽等[9]认为在ccl4诱导肝纤维化形成的过程中，大鼠血清no水平的增高可以进一步导致肝细胞炎症及损伤，no在ccl4所致大鼠肝纤维化中具有氧化应激的作用。在no与hsc相互关系的研究中，failli p等[10]认为，no可与其受体结合，使cgmp合成增加并发挥第二信使作用，如降低细胞内游离钙引起舒张，通过自分泌和旁分泌的方式来调节hsc的收缩。本实验中，ccl4可显著升高no，因而可能通过增加炎症介质释放与增强氧化应激而促使肝纤维化的形成。
tgfβ1可刺激基质的合成，减少其降解。tgfβ1是所有激活hsc细胞因子中最强的细胞因子[11]。tgfβ不但诱导hsc的激活，还可增强细胞pdgf受体的表达，增强细胞tgfβ自分泌的表达，还通过减少凋亡来延长激活的hsc的存活。tgfβ1也通过抑制mmps合成、促进timps及纤溶酶原激活抑制因子(pai)生成而抑制ecm的降解[12]。tgfβ1还可刺激其他细胞因子的分泌，如可刺激hsc的pdgf受体的表达，增加pdgf促hsc增殖作用。ccl4可增加大鼠体内tgfβ1的表达，以此促进肝纤维化的形成。
pdgf是体外最有效的诱导hsc增殖的细胞因子，激活的hsc表达更多的pdgf受体并释放pdgf。tgfβ1选择性地促进人类hsc的pdgfa链和pdgfrβ亚单位mrna的表达,而对b链和α亚单位的表达没有影响。tgfβ可使pdgf与pdgfr的结合增加，说明tgfβ可通过转录后机制调节pdgfrβ亚单位的活性[13]。
tnfα主要是由kupffer、hsc、单核巨噬细胞等细胞产生，与受体结合后，能促进炎症活动及细胞毒作用，主要通过nfκb而发挥生物学效应。在肝纤维化进程中，tnfα刺激hsc3 t、l1脂肪细胞等的胶原合成，加速tgfβ对hsc、mfblc转化，促进其糖胶多糖、纤维连接素等基质的合成[14];tnfα作为重要的刺激源，使hsc活化，导致ecm合成增加并分泌多种细胞因子，可促使活化的hsc自分泌多种细胞因子,如il6、ill、egf、etl、tgf等，发挥各种生物学活性。tnfα还能消除tgfβ1对人和鼠hsc增殖的抑制作用。tnfα能加强hsc的增殖，促进hsc向肌成纤维母细胞(mfb)转化，增加tgfβ刺激ecm的合成作用。另外,tnfα可还诱导hsc的结缔组织生长因子mrna表达,是其参与早期肝纤维化形成的作用机制之一，可能通过tgfβ1所介导。
本研究结果表明，模型组大鼠血清no、tgfβ1、tnfα水平较正常对照组、溶剂对照组明显升高，免疫组化显示pdgfbb在肝细胞、窦旁细胞、纤维间隔中大量表达，提示通过促进上述细胞因子的表达，可能是ccl4腹腔注射致肝纤维化的作用机理之一。而有关ccl4制作肝纤维化模型的其他机制，有待进一步探讨。
【 参考 文献 】
[1] jiao j,friedman s l,aloman c. hepatic fibrosis[j]. curr opin gastroenterol， 2009,25(3): 223-229.
[2] 何雅军，舒建昌，吕霞，等. 姜黄素预防肝纤维化作用与肝星状细胞的关系[j]. 中华肝脏病杂志，2006，14(5):337-340.
[3] 舒建昌,叶国荣,吕霞,等. 姜黄素 治疗 肝纤维化及其作用机制的初步研究[j]. 中华肝脏病杂志，2007，15(10):753-757.
[4] 舒建昌,王红利,叶国荣,等. 姜黄素治疗肝纤维化及相关细胞因子变化的研究[j]. 中药材，2007，30(11):1426-1432.
[5] 舒建昌,吴海恩,皮新军,等. 姜黄素抑制肝纤维化大鼠脂质过氧化物的生成及肝脏tgfβ1和pdgf的表达[j].
