作者：贝伟剑，郭姣，胡因铭，黄利华，胡旭光，曹扬
【摘要】 目的 研究快速筛选调节肝脂酶活性中药成分的方法。方法 利用大鼠肝组织匀浆和比色法检测肝脂酶(hl)活性，观察不同实验条件及中药成分对 hl活性的影响。结果 正常大鼠肝组织匀浆具有明显的hl酶促动力学特性，其hl脂解活性有明显ca2+依赖性，受钙调蛋白拮抗剂盐酸异丙嗪抑制，符合纯化hl的酶促动力学特性;筛选得到齐墩果酸和人参皂苷rb2 2个增强肝脂酶活性成分。结论 首次用大鼠肝组织匀浆和脂酶比色测定法建立了一种简便易行、快捷的调节肝脂酶活性中药有效成分筛选方法，可用于影响肝脂酶活性的中药调脂活性成分的筛选，并从有效方药组分中筛选得到有增强hl活性的组分。
【关键词】 肝脂酶;快速筛选;大鼠肝匀浆;复方贞术调脂方;肝脂酶激活剂
abstract:objective to study the new approach for rapid screening of active ingredients from chinese medicine regulating hepatic lipase activities.methods rat liver homogenate and colorimetric assay of hepatic lipase (hl) activities were used to investigate the effects of different components of chinese medicine on hepatic lipase activities.result it was found that liver homogenate of sd rats demonstrated significant enzyme kinetic properties of hl. its lipolytic activities was significantly ca2+dependent,and inhibited by calmodulin antagonist promethazine hydrochloride,consistent with the enzymatic kinetic properties of purified hl reported in the literature. oleanolic acid and ginsenosides rb2 was screened out as the activators of hl.conclusion the method for rapid screening of the active ingredient of chinese medicine regulating hl activities by using rat liver homogenate in combination with colorimetric assay of hl activities was developed,which was simple and reliable,and could be used in .rapid screening of lipidlowering ingredients in traditional chinese medicine having effects on hl activities,and screening of active ingredients that might increase hl activities from effective recipes of traditional chinese medicine.
key words:hepatic lipase (hl) ; rapid screening; rat liver homogenate; fufang zhenzhu tiaozhi fang(ftz) recipe;hepatic lipas activator
肝脂酶(hepatic lipase,hl)是重要的脂代谢酶，其合成、分布、活性的变化和高脂血症、脂肪肝、动脉粥样硬化等密切相关。WwW.11665.CoM肝组织和血浆中hl酶活性的降低，可引起高脂血症[1-3]，并在脂肪肝发病中起重要作用[4，5]。
复方贞术调脂方(简称ftz)由女贞子、丹参、三七、黄连等中药组成，含有齐墩果酸、三七皂苷、黄连素、丹参素等活性成分，在临床应用和实验研究中发现该方不仅具有明显的降低总胆固醇(tc)、三酰甘油(tg)、低密度脂蛋白胆固醇(ldlc)及升高高密度脂蛋白胆固醇(hdlc)的作用,并能升高血浆hl活性、抑制动脉粥样硬化(as) 形成、抑制脂肪肝形成等作用[6，7]，还能使饮食性高脂血症模型大鼠降低的肝组织和血浆中hl的活性恢复至正常水平[7]。
为了研究中药降血脂的物质基础和筛选新药，本研究以hl为靶点，以ftz组分为调节hl活性成分的筛选对象，研究建立一种采用大鼠肝匀浆比色法测定肝脂酶活性，快速筛选调节hl活性中药有效成分的方法，现报道如下。
1 材料与仪器
1.1 材料与试剂
ftz提取物 称取ftz处方药材(由女贞子、丹参、三七、黄连等按2∶1∶0.5∶0.5质量比组成)，置圆底烧瓶中，加70%(φ)乙醇8倍量，浸泡0.5 h，加热回流提取1.5 h，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩，浓缩液备用;药渣加水8倍量，加热回流提取1.5 h，滤过，浓缩，合并浓缩至3 g生药/g浸膏,临用时用0.1 mmol/l triscl缓冲液溶解稀释至相应浓度。
三七总皂苷、人参皂苷rb2、齐墩果酸、盐酸小檗碱、丹参素由 中国 药品生物制品检定所提供;总脂酶试剂盒(南京建成生物工程研究所);大鼠肝脂酶的elisa测定试剂盒(武汉中美科技);磷酸盐等试剂均为国产分析纯试剂; 盐酸氯丙嗪(sigma公司);十二烷基硫酸钠(sds)、二硫代苏糖醇(dtt)(amresco)。
1.2 实验动物
spague dawley(sd)大鼠,由广东省实验动物中心提供，雄性，体质量200～250 g，符合spf级标准，合格证号：检证字2009a056。
1.3 主要仪器
specord s600分光光度计(德国耶拿)、biotek elx800酶标仪(美国biotec)、hc3018r离心机(科大创新)、高速冷冻离心机(eppendorf)、高速匀浆机(ika)。
2 方 法
2.1 大鼠肝脏匀浆制备及hl含量测定
取健康雄性大鼠，禁食一晚，乙醚麻醉后断头处死大鼠，迅速取出肝脏,在冰浴上剪成碎块，用4 ℃预冷的生理盐水洗去血液，用4 ℃预冷的0.1 mol/l trishcl( ph=9.5)在冰水浴中制成10%(1 g/10 ml)的匀浆,组织匀浆至显微镜下无完好细胞，低温下8 000 r/min离心5 min，取脂层下清液，加入dtt至1 mmol/l，保存于-70 ℃冰箱中备用。bradford法测定肝匀浆中蛋白质含量,用酶联免疫吸附试验(elisa)法测定匀浆中hl酶蛋白含量。
2.2 肝组织匀浆中hl活力的比色测定方法
hl活性测定是以脂肪乳剂为底物,在37 ℃、ph 9.5 条件下与一定量的肝匀浆37 ℃水浴保温30 min，肝匀浆中的hl可将底物中的tg 水解为甘油和游离脂肪酸(free fatty acid,ffa),用有机溶剂二次提取ffa，铜试剂比色法测定生成的ffa 含量, 计算 反应体系肝匀浆中肝脂酶的比活性[1 u=1 μmol/l ffa/(h·mg)，即每毫克匀浆蛋白每小时在反应系统中催化生成1 μmol/l的ffa定义为1个酶活性单位][8，9]。
三酰甘油乳剂：0.82 ml三油酸甘油酯，1 g阿拉伯胶，1.5 g白蛋白加含1 mol/l nacl、 0.005 mol/l ca2+的0.1 mol/l ph9.5 trishcl缓冲液至100 ml，制成乳剂。
酶活力测定反应体系总体积为1 ml，包括0.1 mol/l trishcl 0.74 ml (ph=9.5，ca2+5 mmol/l)，20% bsa 0.1 ml,脂肪乳剂10 μl,10 mol/l nacl 0.l ml,肝组织匀浆上清液50 μl。
2.3 大鼠肝匀浆hl酶活性测定条件的优化
2.3.1 匀浆量对大鼠肝hl活性的影响 配制ph值9.5的trishc1系统，加入相关的试剂，分别加入5、10.0、20.0、30.0、50.0 μg/ml的肝匀浆，按上述方法操作，测定加入不同肝匀浆量的hl活性，确定测定肝匀浆中hl活性的最佳匀浆量。
2.3.2 反应体系ph对大鼠肝hl活性的影响 配制不同ph值的trishc1系统，加入50 μl的肝匀浆和相同量的相关试剂，按上述方法操作测定不同ph值(7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)的trishcl反应系统中肝匀浆的hl活性，确定测定肝匀浆中hl活性的最佳ph条件。
2.3.3 温度和dtt对酶活性影响 收集肝组织匀浆后立即测定肝脂酶活性,然后分别测定25 ℃、4 ℃、-20 ℃、-70 ℃下保存24 h的肝脂酶活性，并测定加终浓度为1 mmol/l的dtt 肝组织匀浆在 4 ℃、-20 ℃，-70 ℃保存24 h、30 d时的hl活性。
2.3.4 反应时间对肝匀浆hl活性的影响 在ph9.5的triscl反应体系中，分别加入50 μl 肝匀浆，37 ℃分别温育0、10、30、60、90、120 min，测定hl活性，确定肝匀浆中hl活性与反应时间的关系。
2.3.5 激活剂钙浓度对肝匀浆中hl活性的影响 在ph9.5的的triscl反应体系中，分别加入不同量的1 mol/l egta溶液，使体系中游离钙浓度(ca2+)分别为0.001、0.005、0.025、0.10 mol/l,然后分别加入50 μl的肝匀浆，按上述方法操作测定不同ph钙浓度下系统中肝匀浆的hl活性，确定钙浓度对肝匀浆中hl活性的影响。
2.4 抑制剂对肝匀浆中hl活性的影响
配制上述优化ph值9.5的trishc1系统，加入50 μl肝匀浆及相同量的相关的试剂，并加入盐酸氯丙嗪至终浓度1、5、25 μmol/l，或加入sds至终浓度0.01、0.1、1.0 mol/l，37 ℃、温育反应30 min,按上述方法操作检测体系中hl活性，确定氯丙嗪、sds对匀浆中hl活性的影响。
2.5 ftz不同调脂组分对大鼠肝hl的影响
在上述优化ph值9.5的trishc1的反应系统中，加入50 μl肝匀浆量和相同量的相关试剂并加ftz的不同活性成分至不同浓度(0.1、0.50、2.50 μg/ml)于37 ℃、温育反应30 min,按上述方法操作，测定ftz不同组分各种浓度时肝匀浆中hl酶的活性，确定对匀浆中hl活性的影响。
2.6 统计学分析
以spss16.0 软件进行统计学处理,所有结果用以均数±标准差(±s)表示,各均数间用t检验，p<0.05为差异有显著性。
3 结 果
3.1 hl活性测定的酶量曲线
以肝组织匀浆上清作为标本,测定不同匀浆蛋白量时hl酶活性，结果如图1。由图1 可见,匀浆量在0～50 μl 之间，hl酶活性随着匀浆蛋白量的增加而递增，匀浆蛋白量与酶活性之间呈一直线关系(r=0.998 8)。
3.2 ph值对肝匀浆中肝脂酶活性的影响
triscl反应体系的ph不同，测得50 μl 肝匀浆的hl活性明显不同,说明ph对肝匀浆的hl活性有明显的影响(见表1)，其最适反应体系ph是9.5，此时酶比活性最大。表1 不同反应体系ph值对大鼠肝hl活性的影响
3.3 肝脂肪酶活性与反应时间曲线
在0～90 min内，酶活性随温育时间延长而增加，温育90 min hl活性达最大值4.98 u，温育30 min hl活性达最大值的91.5%(4.61 u)，但超过90 min，hl活性反而显下降趋势(见图2)。为方便试验，选择30 min作为其他实验温育时间。
3.4 温度对大鼠匀浆hl活性的影响
肝匀浆中hl活性在25 ℃，保存24 h，酶活性下降80%，4 ℃保存24 h酶活性下降35%，在-20 ℃保存24 h，酶活性下降5%，在-70 ℃，保存24 h，酶活性下降3%。说明肝匀浆中hl活性在室温下不稳定，在4 ℃也不够稳定。在-20 ℃和-70 ℃下保存hl酶活性较稳定。
大鼠肝匀浆制备后，立即加入dtt至终浓度为1 mmol/l的肝匀浆中hl酶活性在25 ℃，保存24 h，hl酶活性只下降40%，说明dtt对肝匀浆中hl酶活性有保护作用。加入dtt至1 mmol/l的肝匀浆在-70 ℃下保存1个月，仍有很高hl酶活性，相当于刚制备的肝匀浆hl酶活性的95%(见表2)。说明肝匀浆加入dtt在-70 ℃低温冷冻条件下可较长时间保存而维持其hl酶活性相对稳定。表2 不同保存条件下大鼠肝匀浆hl活性变化
3.5 钙浓度对大鼠匀浆肝hl酶活性的影响
在钙浓度为0.001、0.005、0.025、0.10 mol/l的反应体系中,大鼠肝匀浆中hl酶活性分别比无钙反应体系增加3～9倍,钙浓度为0.005 mol/l时hl酶活性增加最大达9倍(见表3)，表明体系中游离钙浓度(ca2+)对大鼠肝匀浆中hl活性有激活作用。表3 钙浓度对大鼠肝hl活性的影响
3.6 抑制剂对大鼠肝hl的影响
在最适ph9.5的triscl反应体系中，加入氯丙嗪至终浓度分别为1、5、25 μmol/l，hl酶活性分别下降35%、56.7%、75.1%。
在最适ph9.5的triscl反应体系中加入sds至终浓度分别为0.01、 0.1、1.0 mol/l，hl酶活性分别下降36.2%、64.8%、94.0%。
3.7 ftz 不同组分对大鼠肝匀浆hl活性的影响
0.1～2.5 μg/ml 的ftz提取物及其活性成分齐墩果酸、三七总皂苷、人参皂苷rb2能浓度依赖性增强hl活性，增加幅度可达75%，而高浓度盐酸小檗碱则可抑制hl活性，抑制率可达40%;丹参素对hl活性影响不明显(见图3)。
4 讨 论
肝脂酶(hl)是一种由肝脏实质细胞合成和分泌的糖蛋白,主要转运到肝窦状隙内皮细胞表面而发挥生理作用，并在肝中降解 [1，2]。 hl主要生理功能是水解各种脂蛋白中的三酰甘油和磷脂,在乳糜微粒残骸的清除、低密度脂蛋白的形成和胆固醇的逆向转运中起关键作用[1，2]。hl酶活性降低可引起血脂水平(主要为三酰甘油)升高、hdlc降低，进而影响到动脉粥样硬化的发生和 发展 [1-3] ;hl活性的降低还与脂肪肝形成有关[4，5]。维持hl酶活性对调节血脂、防治抗动脉粥样硬化和脂肪肝有重要意义。
人类hl和脂蛋白脂肪酶(lpl)同属于脂酶家族，然而却是两种不同性质的酶。hl活性不需要apocⅱ和肝素激活作为激活剂，不受高盐浓度及鱼精蛋白的抑制，并且其底物特异性不高;而lpl活性目前只能在肝素化后进行。因此，可以在高浓度钠盐而无肝素的反应系统中直接用比色法测定肝脂酶活性[10]。
细胞分子靶标是新药研发的常见快速筛选模型。用hl建立影响hl活性的药物筛选模型有望快速筛选到中药活性成分。但由于制备纯化hl的方法复杂，成本高，一般实验室难以用纯化hl进行大规模筛选实验。比色法是检测大鼠肝匀浆hl活性水平的经典方法[8-10]，为便于在hl分子靶标水平筛选调节hl活性的药物，本研究用大鼠肝匀浆和比色法测定hl活性，建立检测hl活性的快速筛选模型。
研究表明大鼠肝组织匀浆制备的hl酶活性很高，而且较稳定,在-70 ℃下保存其活性可维持稳定1个月以上。在ph 9.5的磷酸钾缓冲液中具有明显的酶促动力学特性，其hl脂解活性有明显ca2+依赖性，受钙拮抗剂盐酸异丙嗪的抑制并受表面活性剂sds的抑制，符合 文献 纯化hl的酶促动力学特性[1,11]。本研究结果显示,大鼠肝组织匀浆中hl酶丰富，制备方法简单易行，成本很低,配合成熟的脂酶活性比色法检测，可用于快速筛选影响hl酶活性的中药调脂活性成分，并从有效方药组分中筛选得到有增强和抑制hl活性的组分。首次实验证明,使用大鼠肝组织匀浆和脂酶比色测定hl活性是快速筛选影响hl活性中药活性成分的灵敏、稳定、可靠的方法。
复方贞术调脂方(ftz)对饮食性高脂血症模型大鼠能使其降低的肝组织和血浆中hl活性恢复至正常水平[7]。本研究还从ftz的成分中筛选得到有明显增强hl酶活性的hl激活剂人参皂苷rb2和齐墩果酸，其可能是复方贞术调脂方提升饮食性高脂血症大鼠肝组织肝脂酶(hl)活性的物质基础之一。
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