作者：杜丰,李荣生,王乃婕,邱琳,张蓓,梁秉文,付桂兰,叶祖光
【摘要】 目的 筛选双氢青蒿素(dha)软膏处方及促渗剂。方法 建立体外经皮渗透试验方法,采用高效液相色谱法对dha样品的体外透皮速率进行考察,并以dha累积透过量作体外透皮曲线,与higuchi方程进行拟合。结果 透皮速率以卡波普水溶性软膏及促渗剂为氮酮的最高,达到27.262 μg/(h·cm2),higuchi方程线性较好。结论 最佳处方为卡波普水溶性基质的dha软膏处方,最佳促渗剂为氮酮。
【关键词】 双氢青蒿素；软膏；体外透皮试验；促渗剂；高效液相色谱法
key words：dihydroartemisinin；ointment；transdermal experiment in vitro；penetration enhancers；hplc
双氢青蒿素(dihydroartemisinin,dha)为青蒿素的还原产物,是青蒿琥酯、蒿甲醚等药物起抗疟作用的中间产物[1],对疟原虫有强大且快速的杀灭作用,能迅速控制临床发作及症状。本试验通过体外透皮试验方法筛选dha软膏处方及不同促渗剂对dha软膏的渗透性进行研究,为dha经皮给药系统(transdermal drug delivery system,tdds)制剂的研究提供参考。www.11665.COm
1 实验材料
1.1 药品与试剂
双氢青蒿素对照品(批号100184-200401,中国药品生物制品检定所提供),双氢青蒿素原料药(批号20050704,购自重庆华立武陵山制药有限公司)。水为高纯水,甲醇及乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯。
1.2 动物
wistar大鼠,体重200 g左右,购自中国医学科学院实验动物研究所,动物合格证号：scxk(京)2005－0013。
1.3 仪器
高效液相色谱仪(waters2695,美国),检测器(waters2996,美国),透皮扩散试验仪(tk-12a型,上海锴凯科技贸易有限公
2 方法与结果
2.1 体外透皮试验方法学考察
2.1.1 色谱条件[2]
kromasil c18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：乙腈-水(60∶40)；流速：1 ml/min；检测波长：216 nm；柱温：25 ℃。在该色谱条件下dha与其他成分能达到基线分离,阴性对照无干扰,见图1。
2.1.2 对照品溶液的配制
精密称定dha对照品10.13 mg,置10 ml量瓶中,加适量甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得对照品贮备液(1.013 mg/ml)。
2.1.3 供试品溶液的制备
取dha样品涂于已处理好的大鼠皮肤上,做体外透皮试验,接受液经0.45 μm微孔滤膜滤过,即得供试品溶液。
2.1.4 阴性对照溶液的制备
取不含dha的阴性对照样品,按“2.1.3”项下方法操作,即得阴性对照溶液。
2.1.5 标准曲线的建立
精密吸取对照品贮备液,用接受液定容,配制一系列不同浓度的溶液(0.025 325、0.050 65、0.101 3、0.202 6、0.405 2、0.759 75、1.013 mg/ml)。精密吸取上述溶液各10 μl,分别注入液相色谱仪,记录峰面积。以dha峰面积为纵坐标,进样量(μg)为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程：y＝311 707.799 4x－1 355.167 2,r＝0.999 9。结果表明,dha在0.253 25～10.13 μg范围内线性关系良好。
2.1.6 精密度试验
取供试品溶液,重复进样6次,以dha含量计算,rsd＝0.64%。
2.1.7 稳定性试验
取供试品溶液,分别于0、4、8、12、16、20、24、48、56 h进样10 μl,测定,以dha含量计算,rsd＝0.95%。样品在取样后2 d内完成含量测定,保证样品的稳定性。
2.1.8 回收率试验
取阴性对照溶液,按一定比例加入dha对照品溶液(1.013 mg/ml),配制成浓度为0.050 65、0.202 6、0.506 5 mg/ml的溶液,以dha含量计算,求得平均回收率为98.67%(n＝9),rsd＝2.04%。
2.2 处方筛选
2.2.1 dha软膏的制备
2.2.1.1 油溶性软膏的制备
处方：单硬脂酸甘油酯、白凡士林、液体石蜡、氮酮、油酸、dha。制法：称取处方量的药物基质置容器中,水浴75 ℃加热至熔化,搅拌混匀,冷凝,即得。
2.2.1.2 水溶性软膏的制备
处方一：卡波普980、甘油、吐温-80、氢氧化钠、蒸馏水、氮酮、油酸、dha。制法：将卡波普与吐温-80、甘油及适量蒸馏水混匀；氢氧化钠用剩下的水溶解后加入上液,搅匀,即得透明凝胶；再将氮酮、油酸、dha加到凝胶中,充分搅拌直至均匀,即得。处方二：泊洛沙姆407、聚乙二醇400、氮酮、油酸、dha。制法：称取处方量的药物基质置容器中,水浴75 ℃加热至熔化,搅拌均匀,冷凝,即得。
2.2.1.3 乳膏的制备
处方一：硬脂醇、白凡士林、十二烷基硫酸钠、丙二醇、氮酮、油酸、dha、蒸馏水。制法：将硬脂醇、白凡士林、氮酮、油酸、dha置容器中,水浴加热至熔化,保温于85 ℃；将十二烷基硫酸钠、丙二醇、蒸馏水加热溶解,并保温于85 ℃,将水相缓慢加入油相中,搅拌至冷凝,即得o/w型乳膏。处方二：硬脂醇、白凡士林、司盘-80、氮酮、油酸、dha、蒸馏水。制法：取硬脂醇、白凡士林、司盘-80、氮酮、油酸、dha置容器中, 水浴加热至75 ℃熔化,保温；蒸馏水加热至80 ℃,趁热缓慢加入油相中,搅拌至冷凝,即得w/o型乳膏。
2.2.2 体外透皮试验
2.2.2.1 皮肤处理
大鼠处死后,用电动剔毛器将其剔毛后,取其腹部皮肤,去除脂肪层,用生理盐水洗涤,备用。
2.2.2.2 试验条件
试验装置为改良的franz扩散池；水浴温度为(37±1)℃；磁子转速为(400±5)r/min；接受液为20%乙醇生理盐水；接受液体积约为6 ml；释放面积约为2.92 cm2。
2.2.2.3 试验方法
将dha样品涂在大鼠皮肤角质层上,在设定的时间取样,全部取出接受液,每次取样后重新注满接受液,并排除接受室中的气泡。
2.2.3 结果
以单位面积dha累积透过量作体外透皮曲线图,并处理回归higuchi方程及计算透皮速率j[3],见图2、表1。表1 不同dha软膏处方的higuchi方程及透皮速率j(略)
结果表明,透皮速率以卡波普水溶性软膏为最高,回归方程线性较好,且软膏均匀、细腻、涂展性好,故选择卡波普水溶性软膏为dha的处方。
2.3 促渗剂的筛选
以卡波普水溶性软膏为dha处方基质,加入一定促渗剂,制成软膏。按照“2.2.2”条件和方法操作,分别于3、6、9、12、24 h取样,按照“2.1.3”方法处理,测定dha峰面积,计算单位面积dha累积透过量,并作体外透皮释放曲线图及对曲线进行直线回归,见图3、表2。 表2 含不同促渗剂dha软膏的higuchi方程及透皮速率j(略)
以上试验表明,含有促渗剂比不含促渗剂的dha软膏的体外透皮速率高,而又以含有氮酮的最高,且回归方程线性较好,故选择氮酮为dha软膏的促渗剂。
3 讨论
由于dha存在α、β异构体,故本研究采用α、β两峰面积之和计算dha含量。根据文献报道,测定dha方法中流动相的比例为乙腈-水(80∶20)[2],但α、β峰分离得不是很好,而调整为乙腈-水(60∶40),α、β峰可得到良好分离。
5种软膏都是经过初步筛选得到的,他们的外观性状均较好,稠度适中、均匀、细腻、无刺激性等。在处方筛选中,软膏中不加促渗剂,dha难以透过皮肤而造成处方筛选的结果有偏差。为此,在所有处方中添加相同的促渗剂,能够筛选最佳的处方。根据药物脂溶性强的性质,选择氮酮与油酸组合的促渗剂作为处方筛选中固定的促渗剂。
在促渗剂筛选中,促渗剂的浓度太高会使软膏难以成型或者引起皮肤刺激性。为此,本研究选择合适浓度的促渗剂,既能保证软膏成型,又能在无刺激性的情况下促进药物的渗透。据报道,挥发油类促渗剂日益受到人们的重视。本试验初步筛选了丁香油、肉桂油、薄荷油、冰片等挥发油类促渗剂,发现丁香油、肉桂油、薄荷油等在该色谱条件下对dha样品有干扰,冰片则没有。为此,对冰片进行了透皮试验研究,结果冰片的促渗效果不佳。中药挥发油成为常规促渗剂有待深入细致研究。
【参考文献】
[1] 叶祖光.青蒿素类抗疟药研究二十年[j].国外医学·中医中药分册, 1995,17(5)：3.
[2] 刘 宁,杨腊虎,张正行,等.双氢青蒿素差向异构体转化的研究[j].药物分析杂志,2002,22(4)：303－306.
[3] 周莉玲,侯海霞,李 锐.青蒿琥酯透皮吸收研究中接收液的筛选[j].中成药,2000,22(3)：184－187.
