【摘要】 目的 通过对从污染地区分离出的抗汞菌株——溶解肠杆菌yh16的研究，获得新的抗汞操纵子基因，为汞污染环境的微生物修复打下基础。方法 通过质粒消除实验确定抗汞基因的位置，通过构建基因文库的方式筛选获得新的抗汞操纵子基因(mer)。结果 yh16的抗汞操纵子位于质粒上，该操纵子长达6 048 bp，由7个orf组成，依次为mert、merp、merc、mera、merd、tnpa、tnpa，与典型的tn501mer操纵子和tn21 mer操纵子相比，缺少merr。结论 获得了缺少merr基因的mer操纵子，具有理论研究意义，并为抗汞工程菌的构建打下基础。
【关键词】 抗汞质粒;质粒敲除;mer操纵子;汞污染
)abstract:objective in order to obtain the hgresistance operon,the gene library of mercuryresistance strain: enterobacter dissolvens sp. yh16 was constructed. methods plasmidknockout experiment had been used to posit the hgresistance gene,the gene library and bioinformatics analyzing tools had been used to screen the hgresistance gene. results the mer genes were posited in the plasmid and organized as mert，merp，merc，mera，merd，tnpa，tnpa,closely related to that located in tn501 and tn21,but lacking merr.conclusion a different mer operon gene was obtained,which might lay a basis for the further study on the structure analysis and gene clone of it.
key words:hgresistance plasmid; plasmidknockout; mer operon; hg pollution
随着工农业生产的发展和人类活动的不断加剧，环境中汞污染物的排放量与日俱增。wwW.11665.Com环境中的汞可被转化为毒性很强的甲基汞，有可能通过食物链富集并进入人体，对神经、免疫、生殖系统等造成功能上的损害，从而威胁人类健康[1]。自然界存在的抗汞细菌是平时解决环境中汞污染的主角，它们可以将环境中的有机汞降解为无机汞，并进一步还原为毒性低、易挥发的金属汞[2]。目前已经公认微生物对汞及其化合物的抗性通常是由细胞内质粒或跳动基因上复杂转座子中的抗汞性操纵子(mer 操纵子)决定的[3]。
在以往的研究中，通过连续富集培养与驯化的方式，获得了一株具有高抗汞活性的菌株enterobacter dissolvens sp. yh16，其对hgcl2的24 h汞去除率达70%[4]。进一步研究发现，yh16的mer操纵子位于其质粒上，通过构建yh16菌株质粒基因文库，获得了mer操纵子基因，为降解汞生物工程菌的构建奠定了基础，对解决环境中的汞污染问题具有重要的应用意义。
1 材料与方法
1.1 培养基
lb培养基与la培养基按照分子克隆手册配制[5]。
1.2 菌株
大肠杆菌xl1blue [hsdr17,supe44,reca1,enda1,gyra46,thi1,rela1,lac/f]由本实验室保存。抗汞菌株enterobacter dissolvens sp. yh16由本实验室从汞污染土壤中分离获得。pbluescript sk(-) 质粒购自takara公司。
1.3 酶和试剂
各种限制性内切酶、dna marker、xgal、iptg购自takara公司，t4连接酶、去磷酸化酶购自mbi公司。其他生物化学试剂均为国产分析纯。
1.4 菌株enterobacter dissolvens sp. yh16的质粒消除
用eb对yh16的质粒进行消除，处理浓度与温度时间分别为20 mg/l，45 ℃，24 h;20 mg/l，30℃，24 h;10 mg/l，45 ℃，24 h。将处理后的培养液稀释并涂lb平板，30℃培养过夜后影印到含hgcl2 20 mg/l 的lb平板上，30 ℃培养24 h观察结果，分别挑取抗汞活性丢失菌株与未丢失抗菌活性菌株以碱裂解法小量提取质粒dna，电泳检测。
1.5 抗汞质粒的转化
enterobacter dissolvens sp. yh16质粒的提取，xl1感受态的制备与转化参照分子克隆手册进行[5]。选择培养基为含有hgcl2 20 mg/l的lb培养基。
1.6 抗汞质粒基因文库的构建
参照分子克隆手册提取enterobacter dissolvens sp. yh16质粒和pbluescript sk(-)质粒[5]。yh16质粒dna首先经hindⅲ、bamhⅰ、pstⅰ、ecorⅰ小量不完全酶切后电泳，选取最佳内切酶hindⅲ。再经hindⅲ大量不完全酶切后电泳，按照3 s dna gel purification kit试剂盒说明书割胶回收6～10 kb片断。pbluescript sk(-)经hindⅲ 酶切后去磷酸化后并电泳，割胶回收。将酶切并回收的dna片断与去磷酸化的克隆载体按5∶1的比例16 ℃连接过夜，转入大肠杆菌xl1，并涂布la平板，进行蓝白斑筛选。
1.7 目标亚克隆的筛选
挑取白色转化子至lb液体培养基中，37 ℃摇床培养10 h左右后(a600控制在1.5左右)，以1 %的量接入含hgcl2 20 mg/l的lb液体培养基中，30 ℃、160 r/min培养1 d，分批处理样品，再用原子吸收光谱测量lb中的汞[4,6]。同时提取质粒酶切验证。
1.8 亚克隆测序与分析
测序由上海博亚生物公司完成。对插入片断通过orf finder (open reading frame finder) (http://ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf)寻找读码框，并采用blastn (http://ncbi.nlm.nih.gov/blast/cgi?)进行同源性分析。
2 结果与分析
2.1 菌株enterobacter dissolvens sp. yh16的质粒消除
用传统的碱裂解法提取enterobacter dissolvens sp. yh16质粒并电泳证实，yh16含有细胞内质粒。质粒消除后，分别挑取抗汞活性丢失菌株与未丢失抗菌活性菌株以碱裂解法小量提取质粒后电泳，结果见图1。实验发现，抗汞活性丢失菌株质粒已丢失，说明抗汞基因可能位于质粒上。
2.2 菌株enterobacter dissolvens sp. yh16质粒直接转化大肠杆菌实验
质粒可以在不同的微生物之间迅速转移，并赋予受体菌相应的基因型与表型变化，选择将yh16的质粒转化进入与溶解肠杆菌亲缘关系非常近的大肠杆菌xl1中，获得转化菌株yzxl1。结果表明，获得了yh16质粒的yzxl1拥有了抗汞能力，最高能在含hgcl2 40 mg/l的lb培养基上生长，24 h去汞率高达72.2%，处理不同时间后汞残留量见图2。
对yzxl1提取质粒发现，其质粒电泳图与yh16原始质粒完全相同，结果见图3，说明它们来自于同一质粒。
2.3 菌株enterobacter dissolvens sp.yh16质粒dna的提取和不完全酶切
分别使用hindⅲ、bamhⅰ、pstⅰ、ecorⅰ不完全酶切yh16质粒dna，并电泳检测，结果见图4，确定hindⅲ为最佳内切酶。
2.4 连接、转化以及转化子的检验
用去磷酸化的载体与纯化后的酶切片段连接过夜，纯化后电击转化xl1。取100 μl的菌液涂布到添加了xgal、iptg和20 mg/ml hgcl2的la平板上，30 ℃培养过夜，获得白色菌落3个，分别命名为yz161，yz162，yz163。将单菌落接种到含有20 mg/ml hgcl2的la液体培养基中培养并甘油保存。
检验3个亚克隆的抗汞活性。研究发现，克隆子yz163具有最高的抗汞活性，24 h汞去除率为53.6 %，处理后的汞残留量结果见图5。
2.5 阳性克隆yz163的质粒酶切验证与测序
挑选降解率高的阳性克隆子yz163提取质粒并酶切，结果见图6。从图中可知，yz163连接上了大约6 kb和1.5 kb左右的2个片段。将其送至生物公司测序，测序结果略。
2.6 序列分析
通过测序与orf分析发现，yz163所含重组质粒上的插入基因全长为7 488 bp， 其中mer操纵子长达
6 048 bp，由7个orf组成。经blast发现，7个orf依次为mert、merp、merc、mera、merd、tnpa、tnpa，与典型的tn501 mer操纵子tn21 mer操纵子相似[7]。
将7个orf序列进一步比对发现，tnpa与enterobacter aerogenes plasmid r751 来源的tnpa 100%同源(genebank：aac64438.1)。mert、merc与其他种属来源基因差异较小，尤其与pantoea agglomerans来源的mert、merc仅有5个氨基酸的差别(genebank：caa70196.1;genebank：aam44225.1)。mera、merp、merd 与klebsiella pneumoniae来源的mera、merp、merd同源性很高(genbank:aam44226.1;genbank: aam44224.1;genbank: aam44227.1)，但mera n末端缺失82个氨基酸。
3 讨 论
不同来源的mer操纵子具有不同的组分和多样的排列顺序，革兰阴性菌mer操纵子的基因排列大部分是一个典型merrtp(c)ad型[2]，2种典型的mer操纵子结构如图8所示[2]。然而yh16来源的mer操纵子并不以调控基因merr开始，相似的情况曾在革兰阴性菌中被发现,缺少merr/merd操纵子的shewanella putrefaciens是革兰氏阴性mer操纵子模式的另一个例外，这个质粒mer操纵子是一个mertpca排列，到目前为止，还是一个未知的mer调控方式[8]。
yh16的mera的n末端缺失82个氨基酸，有报道称这可能是利用一个不常见的半胱氨酸的糖派生物——分支硫醇，代替谷胱甘肽作为它的细胞硫醇的有机体。
mert上游邻近的orf序列经分析为亚硫酸盐氧化酶基因家族中的一个未知功能的基因，它有一个钼碟啉结合区。其与mer操纵子的关系尚需进一步研究。
对这样一个merr缺乏，含有新基因的mer操纵子的进一步分析研究，有助于更深入了解mer操纵子的作用机制，具有深刻的理论意义。同时，通过进一步构建该操纵子高表达重组质粒的构建以及高效工程菌的开发，有助于解决环境中汞污染的难题，在保护生态环境，维护人民健康等方面具有重要的应用潜力。
【参考文献】
[1] 高芬芳，徐洪兰，罗福堂.利用微生物降解含汞废物的分子机制研究[j].国外医学:卫生学分册，2004，31(6)：330-336.
[2] barkay t,miller s m,summers a o. bacterial mercury resistance from atoms to ecosystems[j]. fems microbiol rev，2003，27：355-384.
[3] hansen l h,so rensen s j.versatile biosensor vectors for detection and quantification of mercury[j]. fems microbiol lett，2000，11：123-127.
[4] 王卓娅，李志红，李荷. 抗汞菌株的筛选、鉴定及其特性研究[j]. 三峡大学学报:自然科学版,2008,30: 72-75.
[5] j 萨姆布鲁克，dw 拉塞尔. 分子克隆实验指南[m].3版.北京：科学出版社，2002：26-45，87-96.
[6] 周桢林，罗进贤，李镇林，等.假单胞菌中抗汞质粒pbh33的分离鉴定[j].中山大学学报，1987(2)：35-36.
[7] kiyono m,omura t,inuzuka m，et al. nucleotide sequence and expression of the organomercurialresistance determinants from a pseudomonas k62 plasmid pmr26 [j]. gene，1997，189(2)：151-157.
[8] ellis r j,morgan p,weightman a j，et al. cultivation dependent and independent approaches for determing bacterial diversity in heavy metal contaminated soil [j]. appl environ microbiol,2003,69(6): 3223-3230.
