【摘要】 目的: 构建人β防御素4（human β defensin 4, hbd4）基因的原核融合表达载体pgex4t2/mhbd4, 诱导gsthbd4融合蛋白在大肠杆菌中表达, 并制备其多克隆抗体。方法: 从重组克隆载体pmd18t/hbd4中扩增hbd4成熟肽编码基因, 并克隆入pgex4t2中, 在iptg诱导下, 表达gsthbd4融合蛋白。以表达的融合蛋白gsthbd4作为免疫原免疫家兔制备抗gsthbd4的抗血清, 抗体效价及特异性分别用elisa和western blot法鉴定。结果: 在大肠杆菌中成功表达mr约为32000的融合蛋白gsthbd4。elisa法检测抗血清的效价可达到1∶128000, western blot分析抗血清可与原核表达的融合蛋白gsthbd4特异结合。结论: 在大肠杆菌中成功表达了gsthbd4融合蛋白, 并制备了gsthbd4的抗血清, 为进一步研究hbd4蛋白的结构和功能奠定了基础。
【关键词】 人β防御素4 基因克隆 融合表达
[abstract] aim: to construct the prokaryotic fusion expression vector of human β defensin 4 （hbd4）, and to express gsthbd4 fusion protein in escherichia coli （e.coli ）and prepare polyclonal antibody of gsthbd4. methods: the gene encoding mature peptide of hbd4 （mhbd4）was amplified by pcr from cloning vector pmd18t/hbd4 which contained the fulllength hbd4 cdna and then cloned into prokaryotic expression vector pgex4t2 to construct pgex4t2/mhbd4. gsthbd4 expression was induced by iptg. the antiserum was prepared by immunizing rabbit with gsthbd4.the titer and specificity of the antibody were detected by elisa and western blot, respectively. results: the recombinant expression vector pgex4t2/mhbd4 was successfully constructed. after being induced by iptg, the fusion protein with relative molecular mass of 32 000 was successfully expressed in e.coli and partly expressed in the soluble form in supernatant. the rabbit antibody against gsthbd4 was obtained. the elisa titer of antiserum against gsthbd4 was about 1∶128 000. western blot analysis showed that the antiserum could bind to the expressed gsthbd4 specifically. conclusion: the rabbit antibody against gsthbd4 has been successfully prepared, which lays the foundation for further studying the structure and function of hbd4.
[keywords]human β defensin 4; gene cloning; fusion expression
防御素是最近在动植物体内发现的一类阳离子抗菌肽。wwW.11665.COM哺乳动物防御素可分为α、 β两类。α防御素主要由中性粒细胞和小肠潘氏细胞产生, 而β防御素广泛表达于多种器官的上皮和黏膜细胞, 在使机体免受外界微生物侵袭中有着重要的作用。人类β防御素（humanβdefensin, hbd）有4种亚型(hbd 1～4), 具有杀伤细菌、 真菌、 病毒、 原虫及肿瘤以及免疫调节等多重活性, 而且不产生细菌耐药性, 因此成为国内外众多学者研究的热点[1-3]。国外研究表明, hbd4对多种病原菌有杀灭作用[4]。然而生物体内天然的hbd4含量很低, 分离纯化难度大, 化学合成成本高。因此利用基因工程技术获得大量hbd4成为必然。目前关于hbd4的体外表达及抗体制备等的相关研究, 国内尚未见报道, 国外研究亦非常少。我们在已获得编码此蛋白的全长216 bp的基因序列并构建了克隆载体pmd18t/hbd4的基础上, 旨在构建hbd4原核表达载体, 在大肠杆菌中大量表达hbd4融合蛋白, 并制备其多克隆抗体, 为进一步研究此蛋白的结构和功能奠定基础。
1 材料和方法
1.1材料 rtaq酶、 4×dntp、 限制性内切酶bamhi、 ecori、 t4 dna连接酶均购自大连宝生物工程有限公司; 含全长hbd4 cdna的重组克隆载体pmd18t/hbd4由第四军医大学西京医院儿科实验室构建。质粒pgex4t2、 大肠杆菌dh5α由第四军医大学生物化学与分子生物学实验室惠赠, 琼脂糖凝胶dna回收试剂盒、 质粒提取试剂盒、 dab显色试剂盒购自天为时代公司。基因测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成, 并经page纯化。hrp标记的羊抗兔igg购自华美公司。家兔由本校实验动物中心提供。
1.2 方法
1.2.1 hbd4成熟肽编码基因(mhbd4 cdna)的获得 根据genbank报道的hbd4成熟肽编码基因序列, 设计2条引物, 以重组克隆载体pmd18t/hbd4为模板, 进行pcr反应。设计上游引物d1: 5′cgggatccgaatttgaattggacagaatatgtgg3′及下游引物d2: 5′cggaattctcagggttttgtacgattcagtaa3′, 其两端分别设计有ecor i和bamh i酶切位点并引入2个保护碱基, 依次加入载体pmd18t/hbd41 μl作为模板, 上下游引物各1 μl, 10×pcr缓冲液5 μl, 4×dntps 4 μl, rtaq dna聚合酶0.2 μl, 去离子水补充反应体积至50 μl, 进行pcr反应: 94℃ 3 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s, 35循环; 72℃ 5 min, 产物在20 g/l琼脂糖凝胶上电泳。
1.2.2 原核表达载体pgex4t2/mhbd4的构建及鉴定 pcr产物于20 g/l琼脂糖凝胶上电泳, 切下目的条带, 用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收目的mhbd4 cdna, 凝胶回收产物用bamh i和ecor i酶切后克隆入后接表达载体pgex4t2中, 转化感受态大肠杆菌dh5α, 将转化菌接种含100 mg/l氨苄青霉素的lb平板上37℃孵育过夜, 挑选多个单菌落接种于含氨苄青霉素的lb培养基中, 37℃振荡过夜,采用质粒提取试剂盒提取质粒, 经bamh i和ecor i双酶切, 10 g/l琼脂糖凝胶电泳, 鉴定与预期结果相似。将鉴定正确的含目的片段的质粒送交上海生工公司测序。
1.2.3 hbd4蛋白的诱导表达 测序正确的阳性克隆菌于含氨苄青霉素100 mg/l的lb培养基中, 摇床培养过夜, 次晨将10 ml的菌液加入1000 ml的lb培养基中, 37℃培养至对数生长期(a600=0.4～0.6)。然后加入iptg诱导融合蛋白表达(iptg的终浓度为0.1 mmol/l), 诱导8 h后, 以10000 r/min离心5 min收菌, 置-70℃冻存。在冰浴中解冻部分冻存的菌体, 重悬于2 ml冰预冷的裂解缓冲液(50 mmol/l nah2po4、 300 mmol/l nacl、 0.1 g/l溶菌酶及1 mmol/l pmsf, ph8.0)中, 置冰浴中15 min, 用超声破碎裂解细胞, 12000 r/min离心20 min, 分别取适量诱导后的全菌及裂解后的上清与沉淀进行sdspage电泳。
1.2.4 兔抗gsthbd4融合蛋白抗体的制备 以上述方法在1000 ml培养液中大量诱导gsthbd4融合蛋白的表达, 离心收菌, 加入20 ml去离子水和等体积的2×上样缓冲液, 煮沸10 min, 离心后取上清进行sdspage, 凝胶经考马司亮蓝染色, 充分脱色后, 切下目的蛋白条带, 研碎溶于少量生理盐水中[5]。取成年家兔2只, 选腹股沟和脊柱两侧为注射点, 多点注射凝胶悬液进行免疫。首次剂量约为500 μg, 其后加强免疫的剂量减半。于初次免疫后4周, 加强免疫1次, 此后每隔2周加强免疫1次, 共3次。末次加强免疫后的第10天, 抽血, 分离血清。
1.2.5 兔抗gsthbd4抗体效价的测定 采用间接elisa法检测抗体效价。用裂解上清(含可溶性gsthbd4融合蛋白, 浓度约为1.0 mg/l), 包被elisa板, 4℃过夜。弃去孔内液体, 用洗涤液(1×pbs, 含0.5ml/l tween20)洗涤3次, 每次3 min。留取1孔加入100 μl稀释液作空白对照外, 其余各孔加入100 μl稀释的待测抗体或未免疫兔的血清, 37℃温育1 h(稀释液为1×pbs, 含0.5 ml/l tween20, 1 ml/l bsa)。洗涤后每孔加稀释的hrp羊抗兔igg 100μl(1∶1000稀释)作为二抗, 37℃温育1 h, 洗涤后每孔加100 μl新配制的dab显色液, 37℃温育20 min。每孔加50 μl2 mol/l h2so4终止反应后, 读取a490值。
1.2.6 兔抗gsthbd4融合蛋白抗体特异性的western blot分析 将含有表达质粒pgex4t2/mhbd4的大肠杆菌dh5α的全菌蛋白, 经sdspage分离, 并转移至硝酸纤维素膜上, 以50 g/l脱脂奶粉于室温封闭1 h后, 加入1∶1000稀释的兔抗gsthbd4融合蛋白抗血清37℃温育1 h, 以tbst室温洗膜3次后, 加入1∶1000稀释的hrp标记的羊抗兔igg作为二抗同上温育及洗膜, 用dab显色试剂盒显色。
2 结果
2.1 pcr结果 以pmd18t/hbd4质粒为模板, d1和d2为引物, pcr反应扩增mhbd4 cdna, 得到近170 bp的目的片段, 与预期大小相符(图1)。
图1 hbd4成熟肽编码基因的pcr扩增结果（略）
fig 1 pcr amplification of mhbd4 cdna
1: 100 bp dna ladder; 2: product of pcr amplification.
2.2 原核表达载体pgex4t2/mhbd4的构建与鉴定 用bamh i和ecor i对重组表达载体pgex4t2/mhbd4进行双酶切鉴定, 与预期结果相符（图2）。测序结果表明, 重组表达载体pgex4t2/mhbd4插入片段的序列为预期的hbd4成熟肽的编码序列。
图2 重组质粒pgex4t2/mhbd4酶切鉴定结果（略）
fig 2 identification of recombinant plasmid pgex4t2/mhbd4 by endonuclease digestion
1: dna marker; 2, 3: recombinant pgex4t2/mhbd4 digested by bamh i/ecor i; 4: recombinant pgex4t2/mhbd4 without digestion.
2.3 融合蛋白gsthbd4的诱导表达及表达形式分析 将重组表达载体pgex4t2/mhbd4转入大肠杆菌dh5α中, 通过iptg诱导表达目的蛋白。表达产物行sdspage结果显示, 可见有新生蛋白条带出现, 表达量为菌体总蛋白的20%～30%, mr约为32000（其中gst的mr 26000, hbd4的mr 6000）, 同预期的相一致(图3)。将表达目的蛋白的工程菌裂解、 离心后, 取上清和沉淀进行sdspage。结果显示表达的蛋白大部分存在于沉淀中, 证明其以不可溶形式的包涵体表达为主, 尚有小部分以可溶性形式存在于上清中(图3)。
图3 融合蛋白gsthbd4的诱导表达及表达形式分析（略）
fig 3 sdspage analysis of the induced expression and expression form of gsthbd4 fusion protein
1: pgex4t2 without induction as a negative control; 2: pgex4t2 induced for 4 h; 3: pgex4t2/mhbd4 without induction; 4: protein marker; 5: debris of the bacteria lysate (insoluble gsthbd4); 6: supernatant of the bacteria lysate (soluble gsthbd4 ); 7: total protein of the induced bacteria as a positive control.
2.4 elisa检测兔抗gsthbd4抗体效价 取末次加强免疫后第10天的血清, 用间接elisa测定抗体的效价, 结果显示, 免疫前的兔血清未测出抗gsthbd4融合蛋白的抗体, 末次免疫后抗血清中抗体效价的滴度达1∶12800以上。
2.5 western blot检测兔抗gsthbd4抗体特异性 用制备的兔抗gsthbd4抗体对原核表达的蛋白进行western blot分析, 结果显示: 在mr约为32000处呈现特异性的结合条带, 而用免疫前兔血清代替一抗则未检测到任何条带。
3 讨论
防御素类抗菌肽作用机制独特, 不易使微生物产生耐药性, 并且因其源于机体本身而具有非常高的安全性, 因此研究开发这类抗菌肽对于解决细菌耐药问题具有重要意义[6]。hbd4 是2001年joseramon对人染色体8p23的基因序列图谱分析时发现一种新的β防御素。hbd4 cdna 216 bp开放读框编码72个氨基酸的前肽、 50个氨基酸的成熟肽。国外研究表明, hbd4对金黄色葡萄球菌、 肉葡萄球菌、 绿脓杆菌、 大肠杆菌等具有抑制和杀灭作用, 特别是绿脓杆菌杀伤作用更强, 是已知其他防御素作用的6倍。hbd4表达于睾丸、 胃窦、 子宫等各种黏膜细胞和上皮组织, 与hbd3、 溶菌酶有协同作用,是单核细胞的趋化物[4]。因此hbd4对人体各个系统的先天免疫尤其是黏膜和上皮的防御起非常重要的作用。因而建立hbd4的原核表达系统, 在大肠杆菌中大量表达hbd4, 以及制备其相应的抗体, 从蛋白质水平检测hbd4的表达就十分重要。
我们利用pcr方法扩增出hbd4成熟肽编码序列mhbd4 cdna, 并重组于gst融合蛋白表达载体pgex4t2中, 经鉴定gsthbd4融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达。以表达gsthbd4融合蛋白作为抗原免疫家兔, 获得了具有较高抗体滴度及特异性的gsthbd4融合蛋白多克隆抗血清。gsthbd4融合蛋白的表达及其多抗制备的成功, 不仅克服了防御素多肽对宿主细胞的毒性作用, 可以方便地利用凝血酶切去其中的gst部分来获得hbd4纯品[7], 为进一步研究hbd4的生物活性及临床应用奠定基础; 而且融合蛋白本身也可增强hbd4免疫原性, 避免了应用传统方法制备抗血清时hbd4来源困难、 成本高的缺点。由于表达的gst蛋白是血吸虫蛋白抗原sj26 (schistosoma japonicum, mr26000), 与人体内的gst有较远的亲缘关系, 因此通过gst融合蛋白制备的抗血清就与人体内的gst没有交叉反应[8], 因此本研究获得的gsthbd4多克隆抗体可用于hbd4的组织分布的检测, 用于hbd4基因表达调节的实验研究。
【参考文献】
[1] fellermann k, stange ef. defensininnate immunity at the epithelial frontier[j]. eur j gastroenterol hepatol, 2001, 13(7): 771-776.
[2] 傅海燕, 张 剑, 路 凡, 等. 人α防御素的融合表达、 纯化及生物活性分析[j]. 细胞与分子免疫学杂志, 2006, 22（2）: 161-163.
[3] cole am, waring aj. the role of defensins in lung biology and therapy[j]. am j respir med, 2002, 1(4): 249-259.
[4] garcia jr, krause a, schulz s, et al. human betadefensin 4: a novel inducible peptide with a specific saltsensitive spectrum of antimicrobial activity[j]. faseb j, 2001, 15(10): 1819-1821.
[5] 董志伟, 王 炎. 抗体工程[m]. 2版, 北京: 北京医科大学出版社, 2002: 264-267.
[6] wimley wc, selsted me, white sh. interactions between human defensins and lipid bilayers: evidence for formation of multimeric pores[j]. protein sci, 1994, 3（9）: 1362-1373.
[7] wu x, oppermann u. highlevel expression and rapid purification of rarecodon genes from hyperthermophilic archaea by the gst gene fusion system[j]. j chromatogr b analyt technol biomed life sci, 2003, 786(1-2): 177-185.
[8] 王国兴, 冯 云, 吴 琦, 等. 人抗菌肽hbd2的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定[j]. 生物医学工程学杂志, 2005, 22(3): 575-579.
