叶酸偶联5氟尿嘧啶白蛋白对肿瘤细胞的毒性及靶向性研究的论文_药学论文

作者：张武雄,凌丽,何练芹,臧林泉,潘雪刁,朱亮

【摘要】 目的研究叶酸偶联5氟尿嘧啶白蛋白在体外对肿瘤细胞的毒性及经叶酸受体介导的靶向性。方法选用叶酸受体表达阳性fr(+)宫颈癌hela细胞及叶酸受体表达阴性fr(-)肺癌a549细胞进行实验。用mtt法观察叶酸偶联物对细胞的毒性作用,同时利用游离叶酸能与叶酸偶联物竞争性结合叶酸受体的原理，考察叶酸偶联物是否具有经叶酸受体介导的靶向性。结果叶酸偶联物对fr(+)hela细胞具有比5氟尿嘧啶原料药更高的抑制率,能有效的靶向fr(+)hela细胞,且细胞毒性作用能被过量的外源性游离叶酸所抑制,而叶酸偶联物对fr(-)a549细胞作用很弱。结论叶酸偶联的5氟尿嘧啶白蛋白能经叶酸受体介导靶向于叶酸受体丰富的肿瘤细胞。

【关键词】 叶酸偶联;5氟尿嘧啶;细胞毒性;靶向性

　　abstract:objective to study the cytotoxicity and targeting ability of folateconjugated 5fluorouracilalbumin via folate receptormediated endocytosis on tumor cells in vitro.methods the folate receptor positive fr(+) hela cell and fr() lung a549 cell were used for experiment. the cytotoxicity of the folateconjugate on tumor cells was measured by mtt assay. according to the competitive inhibition principle and due to that free folate had high affinity for folate receptor,free folic acid was used to validate whether folateconjugate has the targeting ability to fr(+) hela cell via folate receptormediated endocytosis.results the cytotoxicity of folateconjugate to fr(+) hela cell was stronger than 5fluorouracil crude drug in the same concentration,and could be inhibited by excess free folic acid,while the cytotoxicity on fr(-) lung a549 cell was very weak. conclusion folateconjugated 5fluorouracilalbumin could be targeted into tumor cells with rich folate receptors via folate receptormediated endocytosis significantly.

　　key words: folateconjugated; 5fluorouracil; cytotoxicity; targeting

　目前,肿瘤细胞叶酸受体受到广泛关注,已成为肿瘤诊断和治疗研究的新靶点[1-4]。www.11665.Com国内外研究都证明了利用叶酸对受体的高度亲和性,可将药物-叶酸偶联物经叶酸受体介导靶向到高度表达该受体的肿瘤细胞(如鼻咽癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌等),这些肿瘤细胞膜表面上的叶酸受体活性和数量显著高于一般正常细胞[5-8],这为叶酸受体介导药物靶向于肿瘤细胞的研究奠定了基础。据此,本研究以叶酸为靶向基团合成了叶酸偶联的5氟尿嘧啶白蛋白,采用mtt法[9]观察叶酸偶联物对肿瘤细胞的毒性作用,利用游离叶酸能与叶酸偶联物竞争性结合叶酸受体的原理,验证该叶酸偶联物是否具有经叶酸受体介导的靶向性。

　　1 实验仪器与材料

　　1.1 实验仪器

　　swtj水平流净化工作台(苏州市净化设备总厂);model680型酶联免疫检测仪(美国biorad laboratories);hy5回旋式振荡器(江苏省金坛市宏华仪器厂);dk8d型电热恒温水槽(上海一恒科技有限公司);倒置相差显微镜(德国leica dmil);培养箱(thermo forma 371);sz93自动双重纯水蒸馏器(上海雅荣生化设备仪器有限公司)。

　　1.2 实验材料

　　宫颈癌hela细胞、肺癌a549细胞(本院药理教研室保存);mtt(thiazolyl blue 噻唑兰,sigma分装,北京鼎国生物技术有限责任公司);rpmi 1640培养液(吉诺生物医药技术有限公司);rpmi medium 1640无叶酸培养基(cibco);特级胎牛血清(天津市濒洋生物制品科技责任有限公司);胰酶(sigma,北京利科恒达科贸有限公司); 96孔培养板(加拿大 jet biochemicals intl.，inc); 叶酸(企业标准，上海新量化工试剂有限公司);5氟尿嘧啶(5fu，南通精华制药有限公司);5氟尿嘧啶白蛋白(5fub，实验室自制);叶酸偶联的5氟尿嘧啶白蛋白(5fubf，实验室自制),其余试剂均为分析纯。

　　2 方法与结果

　　2.1 药物在体外的细胞毒性[10,11]

　　实验分5组:空白对照组(不加细胞)、阴性对照组(加细胞,不加药)、5氟尿嘧啶组(5fu,阳性对照组)、5氟尿嘧啶白蛋白组(5fub,不接叶酸)、叶酸偶联的5氟尿嘧啶白蛋白组(5fubf,接有叶酸),用含10%(φ)胎牛血清rpmi 1640培养液培养细胞,取处于对数生长期、生长状态良好的细胞,用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞,离心使细胞沉淀,用pbs洗涤,用含10%(φ)胎牛血清无叶酸rpmi1640培养液配成单个细胞悬液,细胞密度为105个/ml以每孔104个细胞接种于96孔培养板中,每孔100 μl。将培养板移入培养箱中,在37℃、5%co2及饱和湿度条件下分别培养24 h后更换100 μl无叶酸rpmi 1640培养液,并分别加入5fu,5fub,5fubf药液各100 μl,使终质量浓度分别为2 μg/ml,10 μg/ml,50 μg/ml的 (偶联物均折算成5fu的等价浓度),再培养36 h后,每孔更换为100 μl无血清无叶酸rpmi1640培养基的培养基,加入20 μl mtt溶液( 5 mg/ml ) ,在微量振荡器上振荡3 min,继续培养4 h,弃培养液,孔加入150 μl dmso,酶联免疫检测仪测定490 nm吸光度(a) 。每种药物浓度设6个复孔。根据抑制率=(1-a药物/a对照)×100%计算抑制率,并以抑制率对药物浓度作图,结果见图1。从图1a中可看出,叶酸偶联物5fubf的对宫颈癌fr(+)hela细胞的毒性最强,其次是5fu,5fub的细胞毒性最弱。而在图1b中原料药5fu对fr(-)a549细胞的毒性最强,叶酸偶联物5fubf与无偶联叶酸的5fubf对fr(-)a549细胞的毒性都很低。

　　2.2 药物在体外的细胞靶向性验证[12]

　　实验分6组: 空白对照组(不加细胞)、未加叶酸的阴性对照组(加细胞,不加药,也不加叶酸)、加有叶酸的阴性对照组(加细胞,不加药,但加有叶酸)、5fu、5fub、5fubf,给药质量浓度均为10 μg/ml (偶联物均折算成5fu的等价浓度),分别用质量浓度为0.1、1、10 μg/ml 叶酸进行阻断。用含10%(φ)胎牛血清rpmi 1640培养液培养细胞,取处于对数生长期、生长状态细胞,用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞,离心使细胞沉淀,用pbs洗涤,用含10%(φ)胎牛血清无叶酸rpmi 1640培养基配成单个细胞悬液,细胞密度为105个/ml,以每孔104个细胞接种于96孔培养板中,每孔100 μl。将培养板移入培养箱中,在37 ℃、φ=5%co2及饱和湿度条件下分别培养24 h后更换100 μl培养液,并分别先在各组中加入50 μl游离叶酸(叶酸质量浓度分别为0. 4、4、40 μg/ml,以使得叶酸终质量浓度为0.1、1、10 μg/ml)阻断叶酸受体,再分别加入50 μl,5fu,5fub,5fubf药液使各药物终质量浓度为10 μg/ml(偶联物折算成5fu的等价浓度) ,培养36 h后 ,同“2.1” mtt法测抑制率,并以抑制率对药物浓度作图,结果见图2,从图2a中可以看出,叶酸偶联物fubf对叶酸阳性受体fr(+)hela细胞的细胞毒性因游离叶酸的浓度不断增大而显著减弱,而游离叶酸对5fu,5fub基本不影响;从图2b中可看出叶酸受体阴性fr(-)a549细胞中游离叶酸的加入对5fu,5fub,5fubf的细胞毒性均无影响。

　　3 讨论

　　研究发现,外源性的叶酸药物复合物与细胞膜表面的叶酸受体特异性结合叶酸药物/叶酸受体复合物周围形成凹陷,在细胞内形成内涵体,在核内体膜质子泵的作用下,内涵体内ph下降,使叶酸-药物/叶酸受体复合物的构象改变,药物从复合物上解离,药物被释到细胞内,而叶酸受体可再回到细胞膜表面,循环转运药物[13]。

　　实验数据处理时用阴性对照减去空白对照的值作为对照的,所有组别吸收值都减去空白值再进行抑制率的计算,阴性对照组是真正的对照组,是加有细胞的;空白对照是不加细胞的,是由于培养基及mtt本身所引起的吸收值,不是由于mtt被细胞还原引起的,故应减去空白值,再进行抑制率的计算。细胞靶向性实验结果发现，无叶酸的对照跟加有叶酸的对照没什么差别,说明叶酸本身对细胞生长没什么影响。为了保持实验的可比性和可靠性,选用了有加叶酸的阴性对照组减去空白组的值作为对照计算抑制率。

　　体外细胞毒性实验结果表明,叶酸偶联物5fubf对宫颈癌fr(+)hela细胞有靶向作用,可经叶酸受体靶向到叶酸受体阳性fr(+)hela细胞,故显示出比原料药5fu更强的细胞毒性,这是因为叶酸偶联物和叶酸受体的结合具有特异性、选择性、亲合力强的特点,通过受体介导作用,增加药物fr(+)hela细胞浓度，可提高疗效,降低毒副作用,达到靶向作用。5fub无偶联叶酸对fr(+)hela细胞的毒性较弱,且由于分子量增大，不利于其穿透细胞膜进入细胞内部,只能经内吞作用进入肿瘤细胞,故作用不及原料药5fu;而fr(-)a549细胞为叶酸受体阴性细胞,故叶酸偶联物5fubf不能经叶酸受体介导靶向到fr(-)a549细胞内,与5fub一样只能经内吞作用进入细胞内,故毒性很弱,都不及原料药5fu的细胞毒性强。

　　体外细胞靶向性验证实验中,5fu、5fub对fr(+)hela细胞和fr(-)a549细胞的细胞毒性均不受游离的叶酸所影响,前者是因为药物无偶联叶酸,后者是因为fr(-)a549细胞为叶酸受体阴性细胞,5fubf只能经内吞作用进入细胞内,故对游离叶酸不敏感;在fr(+)hela细胞中,先加入外源性叶酸进行抑制后,fr(+)hela肿瘤细胞膜表面的叶酸受体被过量的叶酸阻断,叶酸偶联物5fubf无法经叶酸受体介导到宫颈癌fr(+)hela细胞,只能通过内吞作用进肿瘤细胞内,故叶酸偶联物5fubf对fr(+)hela的细胞毒性随着游离叶酸的浓度不断增大而显著降低。这间接证实了叶酸偶联5fubf可通过fr(+)hela细胞膜表面的叶酸受体介导进入细胞。

　　在实验中,换用无叶酸rpmi 1640培养液基于以下两点理由：(1)普通rpmi 1640培养液中含有的叶酸量是体内正常血浆中的1 000倍，而高浓度的叶酸可竞争抑制细胞对叶酸偶联物的摄取,从而影响到实验结果。(2)无叶酸rpmi 1640完全培养液中含有的10%小牛血清是细胞所需叶酸的唯一来源,以保证细胞在生理状态的培养液中生长[12]。

　　本实验探讨了叶酸偶联的5氟尿嘧啶蛋白体外肿瘤细胞毒性和靶向性,证实了叶酸偶联白蛋白可经叶酸受体介导途径靶向富集于叶酸受体丰富的肿瘤细胞,为进一步研究及进行体内动物靶向性研究提供参考。

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