【摘要】 目的 研究缺氧海马神经元中katp对基因bax表达的影响。方法 对原代海马神经元进行缺氧和药物处理，倒置显微镜和nf免疫组织化学法观察细胞生长和形态，mtt法检测细胞凋亡率，rtpcr检测bax基因mrna表达水平。结果 与单纯缺氧组比较，缺氧+二氮嗪组和缺氧+甲苯磺丁脲组的多级神经元百分率和细胞存活率差异有显著性(p<0.01)。缺氧+二氮嗪组中基因bax的mrna表达水平与单纯缺氧组相比下降(p<0.01)，缺氧+甲苯磺丁脲组中基因bax的mrna表达水平相对于单纯缺氧组也有提高(p<0.05)。结论 缺氧时katp的开放对细胞具有保护作用，它通过降低bax的表达抑制缺氧海马神经元的凋亡。
【关键词】 katp;bax基因;缺氧; 海马神经元
abstract:objective to study the effect of katp on gene bax in hippocampal neurons under hypoxia condition.method the neurons were exposed to hypoxia condition or treated with medicine. inverted microscope and immunohistochemistry of nf were performed to assess the growth and morphology of the cells. cell viability was measured with mtt cell assay. rtpcr was used to detect expression of bax mrna levels.results compared with hypoxia groups,the percentage of multipolar neuron and survival rate of primary cultured hippocampal neurons in diazoxide and tolbutamide with hypoxia groups showed statistical difference ( p<0.01). the experiments showed a significant increase in bax mrna levels (p<0.01) in neurons cultured at severe hypoxia condition compared with those cultured at normoxia. in hypoxia groups,tolbutamide increased bax mrna expression (p<0.05),while diazoxide reduced it (n=5 for each).conclusion the activation of katp channels could partially reduce cell death during hypoxia. and it also indicated that katp protects hippocampal neurons from hypoxia by suppressing bax expression.
key words:katp; bax; hypoxia; hippocampal neuron
atp敏感性钾通道广泛分布于中枢神经系统和其他外周组织中，调控多种生理活动。WwW.11665.Com缺氧作为一种重要的生理应激反应，自然也受到katp的调控，但其具体的机制还不是很清楚。bax是一种重要的细胞调节因子，其产物可以使线粒体释放细胞色素c，从而诱导细胞进入凋亡途径。本实验选取了katp特异性激动剂二氮嗪和抑制剂甲苯磺丁脲[1]来处理常氧和缺氧时的神经元，观察katp通道的开关对于基因bax表达的影响，从而初步探讨katp对神经元保护的具体机制。
1 材料与方法
1.1 材料
实验动物 出生后1 d的sd大鼠，雌雄不限，由南方医科大学实验动物中心提供，许可证号：scxk粤20060015。
主要试剂 dmem高糖培养液干粉(gibico);多聚赖氨酸10 mg/l(sigma公司,usa);血清(杭州四季青公司);甲苯磺丁脲(sigma公司，usa);二氮嗪(sigma公司，usa);二步法免疫组化检测试剂盒(dako);trizol(invitrogen，usa);一步法rna pcr试剂盒(takara，japan)。
1.2 细胞培养
取出生后1 d的sd乳鼠，用体积分数75%的乙醇消毒，断头置于dhanks平衡盐溶液中。无菌条件下解剖出大鼠的大脑组织并置于另一含有dhanks的器皿内。轻轻剔除脑膜及血管组织，进一步分离出双侧海马组织。移至含有dhanks的小青瓶内，剪成约1 mm×1 mm×1 mm 小块(以上步骤均在冰上操作) 。加入5倍体积的1. 25 g/ l 胰酶(四季清)(37 ℃) ，消化10 min ，中间轻轻振摇2～3次，用含体积分数20%fbs的dmem终止消化，400目筛网过滤，除去未消化完全的组织块。将过滤得到的细胞悬液移入离心管中，1 000 r/min离心5 min。此时大部分的神经细胞已经沉淀到离心管底部，去除上层培养液，加入新培养液，用吸管轻轻吹打，重新悬浮细胞。将细胞浓度调至1×106个/ml左右，接种于包被有多聚赖氨酸(10 mg/ml，sigma)的培养板中，置于φ=5%的co2培养箱中培养(37 ℃)，48 h后使用阿糖胞甘(arac)处理细胞48 h，以去除其中的增殖细胞，以后每3天换液1次，每次换半量。使用的是含有体积分数10%胎牛血清(四季清)、青霉素1 u/l单位和链霉素100 mg/l单位(gibco)的dmemf12培养基(四季清)进行培养。
1.3 缺氧处理和分组
实验分为6组。①常氧组：细胞于37 ℃孵育,并持续通以950 ml/l o250 ml/l co2 混合气。②常氧+二氮嗪组：细胞培养7 d左右时换为含有100 μmol/l二氮嗪的培养基，细胞于37 ℃孵育，并持续通以950 ml/l o250 ml/l co2 混合气。③常氧+甲苯磺丁脲组，细胞培养7 d左右时换为含有100 μmol/l甲苯磺丁脲的培养基，细胞于37 ℃孵育，并持续通以950 ml/l o250 ml/l co2 混合气。④缺氧组：细胞于37 ℃孵育，并通入950 ml/l n250 ml/l co2混合气24 h模拟缺氧。⑤缺氧加二氮嗪组：细胞培养7 d左右时换为含有100 μmol/l的二氮嗪的培养基，37 ℃孵育，通入950 ml/l n250 ml/l co2 混合气24 h模拟缺氧。⑥缺氧+甲苯磺丁脲：细胞培养7 d左右时换为含有100 μmol/l甲苯磺丁脲的培养基，37 ℃孵育，通入950 ml/l n250 ml/l co2 混合气24 h模拟缺氧。二氮嗪和甲苯磺丁脲都在缺氧前2 h加入培养基中。
1.4 细胞活力检测
采用mtt比色法检测细胞活力，向96孔板内加入mtt(sigma)液，孵育4 h，弃上清，每孔加150 μl dmso(二甲基亚砜)，振荡15 min左右，使紫色结晶物充分溶解，用酶联免疫检测仪(biorad 680)测定a值(570 nm)。每个96孔板均设空白对照,每组各孔a值均为减去空白对照后数值。按以下公式计算各组细胞存活率：细胞存活率(%)=各缺氧和药物处理组a值/常氧组a值。
1.5 nf免疫组织化学检测与分析
细胞接种7 d，取出24孔板内的盖玻片，用pbs洗5 min×3，随后用中性甲醛室温下固定20 min，pbs洗净固定液。按以下步骤进行免疫组化染色：(1)室温3%h2o2孵育5～10 min，以灭活内源性过氧化物酶，pbs洗5 min×3;(2)加一抗(dako)，室温孵育30 min，pbs洗5 min×3;(3)加二步法免疫组化检测试剂盒(dako)中的a液50～100 μl，室温孵育1 h左右，用pbs洗5 min×3;(4)滴加显色剂dab工作液50～100 μl，室温孵育5～10 min;(5)脱水，透明，封固。
1.6 神经细胞形态学观察
在400倍倒置相差显微镜(olympus 1×70)下观察培养神经元的生长状况，每组随机选取6个区域，计算各组细胞中多级神经元(含有3个突起以上)的百分比。
1.7 rtpcr检测
使用trizol(invitrogen，usa)提取细胞的总rna，并测定浓度(beckman du530)。采用一步法试剂盒(takara，日本)进行rtpcr(pe2400)反应。引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。bax的序列： 上游引物5′gagtgtctccggcga attg 3′，下游引物5′tggtgagcgaggcggtgag 3′,扩增产物大小379 bp;内参对照gapdh的序列：上游引物5′ggcatcctgggctacactg 3′，下游引物5′tttgggtgcagcgaacttta 3′，扩增产物大小403 bp。引物的使用浓度均为50 pmol/μl。反应条件：bax最适退火温度是58 ℃。pcr 产物于20 ml/l的琼脂糖凝胶做电泳，凝胶成像系统对电泳条带拍照并进行半定量分析。bax mrna相对表达量以同一反应体系中目的产物电泳条带密度指数与内参gapdh电泳条带密度指数的比值来表示。
1.8 神经元鉴定
用免疫组织化学法检测神经微丝蛋白(neurofilament protein 200，nf200)的表达，进行神经元鉴定。具体方法同上。
1.9 统计学处理
实验数据均采用spss 10.0 软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间的均数比较采用oneway anova及lsdt检验，p<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 神经元形态和存活率的变化
光镜下观察培养7 d左右的神经元，可见突起之间形成稀疏的网络连接，神经元大多以纺锤形(2个突起，称为双极神经元)和星形(有3个以上突起，称为多极神经元)为主，神经细胞胞体饱满，周围有光晕。当对神经元进行缺氧处理后，神经细胞形态出现损伤，表现为细胞突起断裂甚至脱落，胞体萎缩甚至消失，大量细胞凋亡。采用神经元特异性nf200免疫组织化学染色,对所培养的海马神经元进行纯度鉴定,神经元纯度达到95%左右。
为了证明katp在缺氧时对神经元的保护作用，采用katp特异性的激动剂和抑制剂处理细胞，实验发现预先加入katp激动剂二氮嗪的实验组中多极神经元的百分比和神经元存活率都比单纯性缺氧组提高(p<0.01)，而预先加入katp抑制剂甲苯磺丁脲的实验组中多极神经元的百分比和神经元存活率都比单纯性缺氧组降低(p<0.01)(图1，表1)。
2.2 缺氧海马神经原中atp敏感性钾通道对bax基因表达的影响
本实验选取了凋亡相关基因bax，使用rtpcr方法检测其在各实验组中的mrna水平变化。bax的mrna在常氧时有少量表达，缺氧时表达升高，当加入二氮嗪时bax的mrna表达水平与单纯缺氧时相比下降(p<0.01)，在缺氧+甲苯磺丁脲组中bax的mrna表达水平相对于单纯缺氧组也有提高(p<0.05)(图2和表2)。表1 不同处理组多极神经元百分率和存活率的变化表2 不同处理组基因bax mrna的表达水平
3 讨 论
katp通道广泛表达在各种细胞上，调控多种生理活动。越来越多的研究表明,katp通道在各种能量缺失情况下具有保持细胞活力、延缓细胞死亡的功能。缺氧作为一种重要的生理应激反应，自然也受到katp的调控。缺氧时细胞内atp浓度下降，引起katp通道活化，通道开放，导致膜超极化，从而阻止钙超载，达到保护细胞的目的[2]。本实验结果也证明了katp的开关对缺氧海马神经元的保护作用，缺氧时随着katp激动剂和抑制剂处理，多极神经元的百分率和凋亡率也发生了相应的变化。
bax[3,4]是bcl2蛋白质家族成员之一，在常态时以单体的形式存在于细胞质中，当接受到死亡信号时bax以多聚体的形式嵌入线粒体外膜，改变膜的通透性促进膜间隙中包括细胞色素c等促凋亡因子的释放。细胞色素c则可以与apaf1(凋亡蛋白酶活化因子)，caspase9形成凋亡体，诱导细胞进入凋亡途径[5]。实验研究显示，将原代培养的海马神经元进行缺氧或缺氧+药物处理后，bax也随之发生了相应的变化(图2)，推测katp通道开放后抑制基因bax的表达，从而保护海马神经元免于缺氧损伤。bax的表达受到各方面的影响，其中p53是其主要的调控因子，在受到外界刺激时可以转录激活bax的表达[6]。2006年huang等研究发现缺氧时katp可以促进p53的表达，推测katp可能是通过调解p53表达来影响bax，从而调节细胞凋亡[7]。
缺氧是一种非常重要的生理应激反应，在正常发育和肿瘤生长中都有着重要的作用。本实验首次将katp通道与bax联系起来，初步探讨了katp对于缺氧神经元的保护机制。实验中采用的是1 d的sd乳鼠培养的海马神经元，这种新生鼠的神经元与成年鼠的神经元可能具有不同的功能。研究发现很多基因都是在个体出生以后开始被诱导表达的。ying xia等人的实验显示atp敏感性钾离子通道在刚出生的大鼠脑中含量很少，在出生后2周内含量快速增加，至成年时达到最高峰[8]。因此有必要研究成年鼠中katp是否具有同样的功能。
【参考文献】
[1] fujimura n,tanaka e,yamamoto s,et al. contribution of atpsensitive potassium channels to hypoxic hyperpolarization in rat hippocampal ca1 neurons in vitro [j]. neurophysiol,1997,3(77):378-385.
[2] héronmilhavet l,xuejun y,vannucci s j,et al. protection against hypoxicischemic injury in transgenic mice overexpressing kir6.2 channel pore in forebrain [j]. mol cell neurosci,2004,25(4):585-593.
[3] li p f,dietz r,von h r. p53 regulates mitochondrial membrane potential through reactive oxygen species and induces cytochrome cindependent apoptosis blocked by bcl2 [j]. the embo journal,1999,25:6027-6036.
[4] suzuki y,imai y,nakayama h,et al. a serine protease,htra2,is released from the mitochondria and interacts with xiap,inducing cell death [j]. mol cell,2001,8(3):613-621.
[5] nicholson d w,thornberry n a. life and death decisions [j]. science,2003(299)：214-215.
[6] koumenis c,alarcon r,hammond e,et al. regulation of p53 by hypoxia: dissociation of transcriptional repression and apoptosis from p53 dependent transactivation[j]. mol cell biol,2001 ,21(4):1297-1310.
[7] huang lianyan,li wenjun,zou fei. activation of atpsensitive kchannels protects hippocampal ca1 neurons from hypoxia by suppressing p53 expression[j]. neuroscience letters,2006,398(1-2):34-8.
[8] ying,davi eisenman,gabriel g. sulfonylurea receptor expression in rat brain: effect of chronic hypoxia during development [j]. pediatric research,1993,34 (5): 634-641.
