作者：周俊立,蔡晓坤 杨翌 周卫平,王德全 姚振江
【摘要】 目的 分析pnptk融合自杀基因系统对hepg2肝癌细胞的杀伤作用及其对肝癌细胞的杀伤机制。方法 利用重组pcr定点诱变法制备pnptk融合基因，将其插入真核表达载体pcdna3.0中，构建融合基因表达载体pcdna3.0/pnptk，经酶切、pcr及测序鉴定重组体，g418筛选获得稳定转染了pcdna3.0/pnptk的抗性细胞克隆。rtpcr和western blotting检测pnptk基因在hepg2细胞中的表达。台盼兰排斥法测定细胞生长曲线，mtt法检测细胞对相应前药的敏感性及分别在一种和两种前药作用下所导致的旁观者效应。结果 融合基因片段pnptk正确插入了pcdna3.0载体中，pcdna3.0/pnptk在肝癌细胞株hepg2中实现了表达。细胞抗性克隆对相应的前药十分敏感。在两种前药的联合作用下，pcdna3.0/pnptk对肝癌细胞产生了良好的旁观者效应。结论 具有双自杀基因功能的表达载体pcdna3.0/pnptk对肝癌细胞hepg2有着良好的杀伤作用，有望将其应用于肝癌体内治疗。
【关键词】 pnptk融合基因; 肝癌;基因治疗
abstract:objective to investigate the cytotoxic effects of a pnptk chimeric gene on the basis of pnp suicide gene on hepg2 hepatoma cells and explore the potential mechanism of their killing effects.methods a fusion suicide gene,pnptk,was produced by sitedirected mutagenesis technique. and then it was inserted into pcdna3.0 to construct a vector harboring a chimeric gene,pcdna3.0/pnptk. the recombinant was identified by recombinant enzyme,pcr and sequencing. then it was transfected into hepg2 cells by liposomemediated method. the cellular clone stably transfected with pcdna3.0/pnptk was established with g418 selection. the expression of pnptk gene was also detected by rtpcr and western blotting method. the growth curve of cellular clone was determined by trypan blue exclusion test. the sensitivity of the cell clone to its corresponding prodrugs and the caused bystander effects were assayed by mtt method.results the pnptk fusion gene was inserted into pcdna3.0 successfully,and its stable expression in hepg2 cells was confirmed. the cellular clone with the stable expression of pnptk gene was sensitive to its corresponding prodrugs,mepdr and gcv. it was demonstrated that the bystander effects derived from pcdna3.0/pnptk after the synergetic treatment of mepdr and gcv were mighty.conclusion the killing effects of the bifunctional suicide gene vector,pcdna3.0/pnptk,on hepatoma cells are satisfactory. it was promising to apply pcdna3.0/pnptk to gene therapy for hepatoma in vivo.
key words:pnptk chimeric gene;hepatoma;gene therapy
单自杀基因系统治疗肿瘤易引起肿瘤耐药性，又存在着对特定细胞类型的依赖性。WWw.11665.cOM融合自杀基因产物兼具两种自杀基因的功能，使两种自杀基因产生协同作用，从而既克服了细胞类型依赖性，又减少了肿瘤细胞对药物的耐药性，提高了这一疗法的实用性。本实验将一种新型自杀基因系统——大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶(pnp)/6甲基嘌呤脱氧核糖核苷(mepdr)系统[1]与目前已广泛应用的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(mepdr)/gcv[2]系统相结合，构建融合自杀基因表达载体pcdna3.0/pnptk，筛选出稳定表达pnptk基因的抗性细胞克隆，经旁观者效应证实融合自杀基因pnptk对于肝癌细胞的杀伤作用。结果显示，在两种前药协同作用的情况下，pcdna3.0/pnptk对肝癌细胞显示出良好的杀伤作用。
1 材料
1.1 细胞株 肝癌细胞株hepg2购自武汉中国典型培养物保藏中心(cctcc)。
1.2 质粒与菌株 真核表达载体pcdna3.0购自invitrogen公司，携pnp基因质粒ptyrpnp2美国pittsburgh 大学david barlett教授惠赠，含mepdr基因载体pⅱ1.5tk由美国emory大学chialing hsieh教授赠送。大肠杆菌dh5α菌株由本所保存。
1.3 主要试剂与药品 实验所用限制性内切酶、t4dna连接酶、高保真taq酶、dna片段回收试剂盒以及质粒纯化试剂盒均购自takara公司。 g418、胎牛血清、dmem培养基、mepdr购自gib/brl公司;总rna提取试剂盒trizol、脂质体lipofectamine 2000购自invitrogen公司;mmlv逆转录酶、rnasin(rna酶抑制剂)购自promega公司;g418、6mp、台盼兰(trypan blue)、mtt购自sigma公司;gcv由华中科技大学同济医学院药理教研室吴健鸿博士赠送。兔抗mepdr的多克隆抗体由本所免疫室制备，羊抗兔iggap购自华美生物工程公司。大肠杆菌dh5α菌株由本实验室保存。
1.4 引物 由上海博亚生物工程公司合成。引物中含相应酶切位点。融合基因起始密码子前掺入kozak序列[3]。
2 方 法
2.1 融合基因表达载体pcdna3.0/pnptk的制备与鉴定融合基因的制备根据本实验室方法并参照文献方法[4,5] (图1)。
2.2 各基因在细胞中的表达
抗性细胞克隆的筛选方法和步骤详见文献[5]，筛选获得细胞抗性克隆hepg2/pnptk;融合基因表达检测方法和步骤参见精编分子生物学指南[6]。
2.3 细胞生长曲线的测定
按2×103/孔接种各细胞于96孔板，每种细胞平行接种4孔。各细胞均在37 ℃、φ=5%2、饱和湿度条件下进行培养。每隔24 h每种细胞各取1孔，胰酶消化，台盼蓝计数活细胞，取其平均值作生长曲线。
2.4 细胞对前体药物敏感性
以2×103/孔接种细胞于96孔板，每个浓度设4复孔。37℃、φ=5%co2培养至细胞80%融合，更换含不同浓度相应前药的培养液。继续培养96 h，加入mtt溶液，20 μl/孔(5 mg/ml)，继续孵育4 h。终止培养，弃上清，加入dmso(100 μl/孔)，酶联免疫检测仪上测定各孔490 nm波长a值。细胞存活率=a实验组/a对照组×100%。
2.5 旁观者效应[ 7]
将hepg2细胞与hepg2/pnptk细胞配制成1∶1的混合细胞悬液，每组设4复孔。37 ℃、φ=5%co2培养至细胞80%融合，再更换含ic50浓度前药(7 μmol/l mepdr+0.07 μmol/l gcv)的培养液，继续培养。视细胞生长状况，添加含相应前药的新培养液，原培养基不吸弃。8 d后终止培养，mtt法测定活细胞数。
2.6 统计学处理
采用单因素方差分析，两组间差异比较采用t检验，用sas6.12 for windows软件进行统计学分析。
3 结 果
3.1 重组载体的鉴定
酶切、pcr及测序鉴定表明pnptk片段已正确插入pcdna3.0中。
3.2 rtpcr检测目的基因的表达
图2结果显示，融合基因pnptk在hepg2细胞中能够表达。
3.3 western blot检测目的基因表达
蛋白印记分析在分子量约66 kd处获特异性条带，大小与pnptk基因产物相吻合，证明融合基因pnptk能够在hepg2细胞内表达(图3)。
3.4 细胞生长曲线
从结果可以看出，添加前体药物之前，两种细胞生长曲线相似(图4)。
3.5 各细胞对mepdr的敏感性
hepg2对mepdr不敏感，ic50>200 μmol/l。hepg2/pnptk的ic50≈7 μmol/l;当mepdr达100 μmol/l后可杀伤绝大多数细胞(图5)。
3.6 各细胞对gcv的敏感性
hepg2对gcv不敏感，ic50>1 000 μmol/l。hepg2/ pnptk对gcv高度敏感，ic50=0.07 μmol/l(图6)。
3.7 旁观者效应
不论是一种前药单独作用或两种前药联合作用于hepg2细胞，对hepg2组的细胞存活率均无明显影响。在7 μmol/l mepdr单独作用下，hepg2/pnptk组混合细胞的存活率约为48%。但在7 μmol/l mepdr和0.07 μmol/lgcv联合作用下，其存活率仅17%(图7)。
4 讨 论
在肿瘤自杀基因研究中，单自杀基因系统治疗肿瘤已经被广泛应用。单自杀基因系统治疗肿瘤存在着一些难以克服的弱点。首先，单自杀基因治疗的肿瘤复发后，很大一部分细胞对相应前药产生耐药性[8]。其次，不同肿瘤对不同系统敏感性不同，介导的旁观者效应也各不相同[9]。某个系统常仅对特定类型肿瘤有较好疗效。因此，人们希望通过发展融合自杀基因技术来克服这些缺点。所谓融合自杀基因就是利用基因工程技术将两种或多种自杀基因连接在一起而构建的融合基因，兼具两个单自杀基因的功能，有效克服了单基因系统的弱点[10]。rogulski 等[11] 将tk 基因和cd 基因一起整合到逆转录病毒的rna 链上,然后用逆转录病毒转导神经胶质瘤细胞,分别给予gcv和5fc,实验结果表明cdtk 基因系统联合治疗的疗效是单独放疗的100倍,也比单自杀基因系统和放疗联合治疗的效果提高20～40倍。
pnp/mepdr系统在迄今所有自杀基因系统中有着最强的杀瘤效应和旁杀伤效应。而mepdr/gcv系统则是目前应用最为广泛的自杀基因系统之一，并已在肝癌基因治疗中取得了一定的成果。本实验中，我利用这两个系统构建了融合基因真核表达载体pcdna3.0/pnptk，希望能将二者的优势结合起来，提高对肝癌细胞的杀伤效率。从结果来看，达到了预期目的。
在pnptk基因中，mepdr基因可将前药gcv转化为其单磷酸盐形式，进而被细胞内激酶转化为其二、三磷酸衍生物。这些三磷酸衍生物在细胞内的积聚并掺入初生的dna链中抑制了dna聚合酶的活性并最终导致细胞死亡[12]，其旁观者效应是由缝隙连接介导的[13]。而pnp/mepdr系统则能从复制、转录、翻译等多个环节杀伤肝癌细胞，且不论对分裂期还是静止期的肝癌细胞都具有杀伤作用。它的毒性产物是膜透性物质，可以穿过细胞膜持续杀伤周围细胞，其旁观者效应的发挥不需要缝隙连接[14]。鉴于两个基因引起旁观者效应的机理完全不同，因此该融合基因有望充分发挥两个系统的优势，对肝癌细胞产生良好的杀伤效应。融合基因中pnpk基因终止密码子和mepdr基因起始密码子通过重组pcr定点诱变[15]加以剔除，这保证了两个基因在同一个阅读框内。从测序结果看：序列全长中无终止密码子，能翻译成为连续氨基酸;目的序列唯一的碱基突变虽然使编码产物第483位氨基酸由苏氨酸突变为丝氨酸，不过鉴于二者均属于极性、中性氨基酸，应该不会对蛋白质的空间结构产生明显影响;从rtpcr和western blot产物的电泳结果来看，融合基因在hepg2细胞中顺利实现了表达。
实验结果显示，在一种前药mepdr单独作用时，hepg2/pnptk组混合细胞约50%被杀伤。在mepdr和gcv联合作用时，hepg2/pnptk组所致旁观者效应较仅有mepdr单独作用时大大提高，有超过80%的混合细胞被杀伤，细胞存活率只有mepdr单独作用时的1/3左右，显示融合基因在不同前药联合作用下所致的旁观者效应较只给予其一种前药时明显提高。这说明pnp和tk两个基因的融合确实能使两系统的杀瘤机制互为补充，充分发挥两系统各自的优势。不过融合基因对肝癌细胞杀伤效应强大的优势需要在相应前药的协同作用下才能被充分发挥。另外，在前药联合应用时，每一种前药只需相对较小剂量就可以达到单自杀基因系统施加较大剂量单一前药所获得的疗效[16]。在体内治疗中，这有助于减少化疗药物的使用剂量，降低副作用。
本研究在细胞水平上证实了两种融合自杀基因载体对肝癌细胞的杀伤作用，为二者未来应用于肝癌乃至于其他肿瘤的体内治疗作了良好的铺垫。
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