作者：邹忠杰，袁经权，龚梦鹃，沈志滨
【关键词】 代谢组学技术;中药研究;应用
人类对复杂生命体的认识循着从器官/组织、细胞到基因的方式，现在又回到了以整体性研究为特点的系统生物学(system biology)的时代，其鲜明的特征是各种“组学”(-omics)研究的繁荣。代谢组学(metabonomics)是继基因组学(genomics)、转录组学(transcriptomics)和蛋白质组学(proteomics)后新兴的一种组学方法，是系统生物学的重要组成部分，由nicholson于1999年首次提出[1]。代谢组学研究的核心思想在于利用现代分析技术定量测定生物体液(如尿液、血浆、组织提取液等)中的内源性代谢产物，考察生物体在不同状态下(生理病理状态、给药前后等)其代谢产物的变化，通过代谢物图的整体分析直接认识生理病理及生化状态，结合化学信息学分析方法确定内源性小分子代谢物成分的变化模式，获得相应的生物标记物群(biomarkers)，表征或揭示生物体在特定时间、环境下整体的功能状态[1,2]。其后又出现了针对植物的代谢组学研究(metabolomics)[3]。如今代谢组学已在药物毒性及安全性评价、疑难疾病诊断、新药研发及药物作用机制研究等生命科学的多个领域展示了广阔的应用前景[4,5]。wWw.11665.cOm
完整的代谢组学分析流程应包括样品的采集、预处理、仪器分析与鉴定、数据分析及生物标记物意义解读，最终认识机体生化反应机理和生命现象[6]。主要研究手段包括核磁共振谱(nmr)、气相色谱-质谱(gcms)和液相色谱-质谱(lcms)等各种高通量、高分辨、高灵敏度的谱学技术[7]，特别是uplcqtof/ms以其灵敏度高、分析速度快、样品无需衍生化等优点，受到众多研究者的关注[8]。主成分分析(pca) 及偏最小二乘法判别分析(plsda) 等多元模式识别方法是代谢组学常用的数据降维和信息挖掘方法[9]。
中药“多组分、多靶点、整合调节作用”的特点及中医药理论的“整体观、动态观、辨证观”与代谢组学整体性、系统性、综合性相吻合。因此，以代谢组学为主体的系统生物学研究方法可能是现代科学中可以概括中医药抽象整体观思想的重要途径。作者遴选了近年来国内外学者在中药代谢组学研究领域颇具代表性的论文作一综述，希望能够为读者提供一定参考。
1 代谢组学技术在现代中药研究中的应用
1.1 代谢组学与中医证候模型的研究
辨证论治是中医药的特色与精华，“证”是机体在疾病发展过程中某一阶段的病理概括。建立中医“证”动物模型是开展符合中医药理论药效评价的重要前提，由于中医“证”的主观不确定性，缺乏合适的动物模型建立与评价方法，根据不同种属、不同品系动物模型与人的代谢状态的差异，以特征性标记物为参考，寻找模拟人类疾病且适用于药效和毒性等研究的动物模型，将成为代谢组学的重要应用领域之一。chen[10] 应用经典的氢化可的松造大鼠肾阳虚证模型方法，采用gcms和模式识别技术对模型大鼠的尿液进行内源性代谢物分析，发现在氢化可的松诱导下动物初期的代谢活动尤其是能量相关代谢明显增强，儿茶酚胺生物合成通路在药物诱导下加速，肾阳虚模型大鼠造模前后，代谢网络明显偏离出给药前的平衡状态并随时间不断变化。对慢性束缚应激大鼠(肝郁脾虚模型)的血浆代谢表型改变的研究发现：模型组醋酸、乳酸、酪氨酸、低密度脂蛋白等发生较大变化，提示动物能量代谢及脂肪、蛋白质代谢功能异常，与已知的应激状态动物体内代谢的调节过程及结果相一致[11]。
1.2 代谢组学与中药整体疗效、药效物质基础及作用机制的研究
对中药疗效的评价、物质基础及作用机制的研究基本上都是沿用化学药的方法，即使引入了细胞分子生物学的研究加深了认识，但从目前的研究结果分析，中药基本上没有优于化学药的作用特点可言，可能我们忽视了其“君臣佐使”、“升降沉浮”等理论和整体性作用机制很难在单一机制的药理模型和分子水平加以诠释，这就需要建立适用于中药多组分、多靶点整体综合效应的药效评价体系，采用代谢组学的方法来对比分析服用中药前后机体内体液之间所存在的不同，来证实中药的疗效，可能成为未来系统生物学研究中药的重要手段。利用gcms方法观察人参总皂苷对急性冷应激的作用发现[12]：大鼠处于-10 ℃环境中2 h，一方面交感神经系统活动的增强导致儿茶酚胺代谢通路的上调，可以调动机体抵御外来侵害;另一方面，糖皮质激素分泌的增加，尤其是兴奋性氨基酸的大量分泌会对神经内分泌系统、海马区和血脑屏障造成潜在的损害;三羧酸循环和色氨酸代谢可以发挥自身代偿调节机制;肠道菌群在冷应激反应中也发挥了重要作用。预防性给予人参总皂苷(100 mg/kg)14 d，可以有效减弱机体对急性冷应激的反应。zhao[13]利用uplcqtof/ms技术研究了沙棘对急性血瘀症引起的代谢紊乱的逆转作用，且呈剂量相关性，涉及的代谢通路有胆汁酸的生物合成、氨基酸如苯丙氨酸、色氨酸和犬尿酸等的代谢，这些都与血脂水平息息相关。淫羊藿可以使氢化可的松致肾阳虚大鼠代谢谱的偏移恢复到正常位置[14]。以金黄色葡萄球菌为实验对象，结合9种已知抗菌机制的抗生素，基于hplcdad技术和pca来确证尖萼耧斗菜(aquilegia oxysepala)和彭县雪胆(hemsleya pengxianensis w.j. chang)的抗菌作用模式和主要活性成分。发现前者与氯霉素、红霉素等的作用机制相同即作用于细菌蛋白质合成过程[15]，后者抑制细胞壁合成与万古霉素作用机制类似[16]。利用代谢组学方法确证了两种植物的主要活性成分分别是木兰花碱(magnoflorine)和雪胆素甲(dihydrocucurbitacin f25oacetate)。角叉菜胶致大鼠足肿胀是考察药物抗炎作用常用的方法，xie[17]利用实验室常用的hplcuv技术结合pca观察到六味地黄片可以有效恢复炎症引起的代谢网络的改变。二甲肼诱发大肠癌模型组大鼠的代谢谱具有随时间逐步偏离起始点的趋势，而金复康口服液干预组大鼠的代谢谱则表现出先偏离再回归起始点的代谢谱变化轨迹，研究结果与病理实验结果一致。三羧酸循环、色氨酸循环、多胺代谢等代谢通道的波动，以及肠道菌群代谢的紊乱与二甲肼诱导的大肠癌癌前病变相关[18]。四氯化碳致小鼠肝损伤后，小鼠机体能量代谢、氨基酸代谢及脂类代谢都受到不同程度的影响，水飞蓟宾能有效地缓解四氯化碳所造成的体内线粒体功能及氨基酸代谢紊乱[19]。
1.3 代谢组学与中药安全性和毒性研究
由于历史、习惯、地域等原因，同一种药材可能来自不同的植物，不同的药材间也存在代用、混用等问题，这为中药的安全性埋下了隐患，但长久以来并未引起足够的重视。在20世纪90年代初出现了在比利时服用含中药广防己的减肥药导致肾功能衰竭的报道[20]，中草药的安全性问题引起了国内外的广泛关注，而且对中草药的声誉造成极大的损害。现在认为引起毒性的主要是马兜铃酸类成分。灌服马兜铃酸大鼠的尿样代谢物发生明显改变，同型半胱氨酸形成和叶酸循环加速，而同型半胱氨酸的再甲基化和花生四烯酸的生物合成减少，这些均与潜在的肾损伤有关[21]。关木通染毒大鼠的尿液中氧化三甲胺、柠檬酸 牛磺酸、肌酐、甜菜碱等代谢物均有不同程度的下降，而醋酸、丙氨酸则显著上升，这些化合物的变化与已报道的肾毒性化合物引起的变化相似[22]。朱砂[23]和雄黄[24]是常用的矿物药，其主要成分分别是hgs和as2s2，利用nmr技术结合pca、plsda可以观察到它们可能对机体能量代谢、氨基酸代谢和肠道菌群产生“扰动”作用，对肝、肾产生一定的毒性作用。
1.4 代谢组学与中药质量控制研究
同一种药材由于生长环境、采收季节及加工方式等的不同，其所含化学成分可能有很大差异。现阶段中药的质量控制主要是对一个或几个指标成分或活性成分进行定性鉴别和定量测定，这种方式的缺点是显而易见的。近年来国家大力推广指纹图谱技术，但应用还不十分广泛。holmes e[25]和kooy van der f[26]综述了近年来基于nmr和ms技术的中药质量控制的代谢组学研究，文中详细阐述了各种技术的优缺点、实验方法与步骤，其中的实例可提供一定的参考。对不同生长阶段的青蒿和法呢基焦磷酸合酶过渡表达的转基因青蒿的研究显示：两类植物在5个生长阶段化学成分都有明显的变化，两类植物在花蕾期和开花期成分差别明显，从青蒿酸和二氢青蒿酸转化为青蒿素的转存率在生长期间可能存在制约瓶颈[27]。采自不同地域(气候条件不同)和采用不同加工方式的日本当归(angelica acutiloba)，首先由经验丰富的药工判断为高、中、低不同的品质，然后利用gctof/ms技术结合pca分析其质量的差异。质量差的当归(采自寒冷地区)果糖和葡萄糖的含量远高于中、高质量的当归，提示温暖的气候有利于当归品质的提升。不同干燥方式的当归质量也有很大的差异[28]。
在长期的用药实践中，中药形成了自己独特的炮制工艺。中药炮制主要的目的一方面是增强或改变药物的性能，另一方面是降低毒性，这必然涉及化学成分的变化。借鉴代谢组学的思路与技术，结合多变量统计分析方法，就可能识别并鉴定炮制过程中发生变化的成分甚至是微量成分。针对生、熟三七(panax notoginseng)在传统中药中作用的不同，chan[29]利用uplcqtof/ms技术结合pca对二者化学成分进行了全面综合的研究。文章首先探讨了uplc技术在化合物保留时间高重现性的优势，对人参皂苷类化合物，负离子扫描模式灵敏度比正离子模式高7～18倍，但正离子模式可以提供更多的结构碎片信息以辅助结构解析。最后，从生、熟三七中分别找到了74和146个标志性化合物用以区分二者，并对其中的部分化合物如rh4、rk3进行了结构鉴定。
1.5 代谢组学与中药活性成分代谢产物研究
药物代谢产物的研究主要有体外(主要利用肝细胞、微粒体和重组人细胞色素p450等)和体内(主要利用放射性同位素标记的方法)方法，对于中药这样复杂的体系而言，都存在明显的缺陷。正常动物给药前后其体液成分会发生明显的变化，这种变化来自于两个方面，一方面是药物代谢的产物，另一方面是药物引起的机体内源性成分的变化。利用现代各种高通量、高分辨、高灵敏度的仪器如uplcqtof/ms并结合多变量统计分析就可以很容易检测并鉴定这些变化。plumb[30]首先提出利用代谢组学的方法进行药物代谢产物研究的设想，并利用化学物gskx(一个处于研发阶段的药物)验证了这种思路的可行性，与放射性同位素标记的方法相比可以得到同样的代谢产物。chen[31]对以上的设想进行了发展，提出了4种基于代谢组学方法的药物代谢产物研究的方法，并详细论述了其操作方式。基于以上的这些思路，对槟榔碱和槟榔次碱的代谢产物进行了研究，共鉴定槟榔碱代谢产物11个，新的代谢产物n甲基哌啶甲酸来自于碳碳双键的还原反应，新的槟榔次碱的代谢产物是其单酰甘油酯[32]。对槟榔碱1氧化物的研究发现了哺乳动物中新的代谢途径：羧基还原成醛基[33]。
2 讨论与展望
代谢组学作为一种新兴的学科，其新颖的学术思想和强大的发展潜力已吸引了全世界众多科学家的关注，国际知名学术刊物nature、journal of proteome research、analytical chemistry等在近几年连续出版了有关代谢组学的综述和研究论文。国内起步也相对较早，已有多所大学和科研院所进行了相关的研究。从国家自然基金的资助情况看，据作者统计，2003年开始有1项获资助，2007和2008年分别为24和20项(数据来自国家自然科学基金委网站)，相信随着研究的深入，在今后一段时间将会有更多的项目获得资助。
从目前的研究结果来看，已利用代谢组学的方法对证候动物模型、中药的整体疗效及作用机制、安全性及质量控制等进行了一定的研究，获得了相关“证模型”的生物标志物，为阐释中医证候的生物学本质和病症治疗提供了证据;初步建立了适用于中药多组分、多靶点整体综合效应的药效评价及作用机制研究、安全性评价及质量控制的方法[10-28]。把代谢组学的技术即高分辨、高灵敏度的现代仪器分析技术如nmr、lcms等和多变量统计分析方法引入中药炮制和代谢产物的研究，可以说是一种延伸，利用这种方法可以发现炮制过程中发生变化的微量活性成分和微量代谢产物，目前开展的工作虽然并不是很多，但已显示了其巨大的潜力[29,32,33]。
众所周知，中医药认识疾病的方法、理论均缺乏合适的现代科学表达体系，目前仍是一种不能与现代医学相兼容、相通的“语言”。中医药和代谢组学的学术思想方法具有内在相通性：整体性，因而，以代谢组学为主体的系统生物学研究方法可能是认识中医药抽象整体观思想的重要途径。长期以来，对中药药效和作用机制的研究一直沿用化学药物的方法，试图证明哪些成分在起作用，作用于哪个靶点，但是传统用药一般是口服，药物首先要经过胃肠道的吸收才能发挥作用，肠道微生态菌群[34]有可能是一个被忽略的区域，中药有可能通过非直接作用对机体产生效应，引入反映整体观念的代谢组学有可能解开中药作用的神秘面纱。运用代谢组学研究技术，根据不同种属、不同品系动物模型与人的代谢状态的差异，以特征性标记物为参考， 结合传统的中医理论，探索新型中医证动物模型的制作方法将具有十分重要的科学意义。代谢组学方法比传统方法能更快、更准确地发现毒性物质和毒性规律，尤其是多层次、多靶点的综合毒性反应，结合经典的分子生物学手段，将对中药毒性进行整体-局部-系统的全面理解，进而指导中药临床安全用药。代谢组学最成功的应用是英帝国理工大学的nicholson主持的comet(consortium for metabonomic toxicology)研究[4]，这项研究由辉瑞等5家制药厂资助，旨在利用nmr技术获取具有肝肾毒性的化学品所致的啮齿类动物血液和尿液代谢指纹图谱，建立专家预测系统用以临床前候选化合物的毒性筛选，以降低新药研发的风险和费用。《神农本草经》中记载的“下品”多有毒性，中药所致毒性与化学品是否相同?还是有自己独特的特点?我们能否借鉴comet研究的经验建立具有中医药特色的专家预测系统?这同样可以降低新药研发的风险和不良反应的发生。应用代谢组学技术对药材不同生长状态下的不同代谢物组作为一个整体来进行考察，用于药材质量控制，注重中药指纹图谱所忽视的分子本质和初生代谢物的影响，更具全面性和优越性，将更进一步解决中药质量控制的复杂性难题，占领传统药物质量技术标准制定的制高点。
目前，中药代谢组学的研究已取得了喜人的成果，但也应看到，当前代谢组学的研究还处于模式识别和生物标记物鉴定的层次，即无效或有效、对哪些代谢通路产生了影响，如何基于代谢组学研究结果，对中药整体药效作用进行定量表征，阐明中药整体药效作用区别于相应单靶点化学药物的作用特点，如何与经典的形态、功能学相联系，如何与基因组学、转录组学、蛋白质组学整合获得中药作用的全面综合的认识，可能是下一步需要思考的问题，探索性的研究为我们提供了一定的参考[35]。
代谢组学为广大的从事中药研究的科研工作者提供了崭新的思路与视角，在现有化学、药理或毒理的研究基础之上，引入系统生物学尤其是代谢组学的研究思路，伴随着各种高分辨率、高灵敏度的分析技术、多变量统计分析方法[36]和代谢网络数据库[37]的不断完善及各种技术标准[6,38-41]的建立，有可能搞清楚中药的物质基础、 作用机理、配伍规律、代谢产物和毒副作用等，它有可能使有着几千年历史、以经验为基础的中药治病向以科学的方法和标准为基础的现代化的中药治病转变，从而对中医药事业长远地健康发展产生深远的影响。
【参考文献】
[1] nicholson j k,lindon j c,holmes e. “metabonomics”: understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological nmr spectroscopic data[j]. xenobiotica,1999,29(11):1181-1189.
[2] nicholson j k,connelly j,lindon j c,et al. metabonomics: a platform for studying drug toxicity and gene function[j]. nat rev drug discov,2002,1(2):153-161.
[3] fiehn o. metabolomicsthe link between genotypes and phenotypes[j]. plant mol biol,2002,48(1-2):155-171.
[4] coen m,holmes e,lindon j c,et al. nmrbased metabolic profiling and metabonomic approaches to problems in molecular toxicology[j]. chem res toxicol,2008,21(1):9-27.
[5] xu e y,schaefer w h,xu q. metabolomics in pharmaceutical research and development: metabolites,mechanisms and pathways[j]. curr opin drug discov devel,2009,12(1):40-52.
[6] beckonert o, keun h c, ebbels t m, et al. metabolic profiling,metabolomic and metabonomic procedures for nmr spectroscopy of urine,plasma,serum and tissue extracts[j]. nat protoc,2007,2(11):2692-2703.
[7] lenx e m, wilson i d. analytical strategies in metabonomics[j]. j proteome res,2007,6(2):443-458.
[8] wilson i d,nicholson j k,castroperez j,et al. high resolution “ultra performance” liquid chromatography coupled to oatof mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies[j]. j proteome res,2005,4(2):591-598.
[9] trygg j,holmes e,lundstedt t. chemometrics in metabonomics[j]. j proteome res,2007,6(2):469-479.
[10] chen m,zhao l,jia w. metabonomic study on the biochemical profiles of a hydrocortisoneinduced animal model[j]. j proteome res,2005,4(6):2391-2396.
[11] 罗和古,丁杰,岳广欣,等. 大鼠肝郁脾虚证的代谢组学研究[j]. 中西医结合学报,2007,5(3):307-312.
[12] wang x,su m,qiu y,et al. metabolic regulatory network alterations in response to acute cold stress and ginsenoside intervention[j]. j proteome res,2007,6(9):3449-3455.
[13] zhao x,zhang y,meng x,et al. effect of a traditional chinese medicine preparation xindi soft capsule on rat model of acute blood stasis: a urinary metabonomics study based on liquid chromatographymass spectrometry[j]. j chromatogr b,2008,873(2):151-158.
[14] li f,lu x,liu h,et al. a pharmacometabonomic study on the therapeutic basis and metabolic effects of epimedium brevicornum maxim. on hydrocortisoneinduced rat using uplcms[j]. biomed chromatogr,2007,21(4):397-405.
[15] yu y,yi z b,liang y z. validate antibacterial mode and find main bioactive components of traditional chinese medicine aquilegia oxysepala[j]. bioorg med chem lett,2007,17(7):1855-1859.
[16] yi z b,yu y,liang y z. investigation of antimicrobial model of hemsleya pengxianensis chang w.j.and its main active component by metabolomics technique[j]. j ethnopharmacol,2008,116(1):89-95.
[17] xie b,gong t,gao r,et al. development of rat urinary hplcuv profiling for metabonomic study on liuwei dihuang pills[j]. j pharm biomed anal,2009,49(2):492-497.
[18] 邱云平,苏明明,吴大正,等. 金复康对大鼠大肠癌癌前病变的改善作用及尿液代谢物研究[j]. 中国中药杂志,2008,33(22):2653-2657.
[19] 黄欣,龚益飞,王毅,等. 代谢组学方法研究水飞蓟宾对四氯化碳致小鼠肝损伤的保护作用[j]. 高等学校化学学报,2008,29(4):714-719.
[20] vanherweghem j l,depierreux m,tielemans c,et al. rapidly progressive interstitial renal fibrosis in young women: association with slimming regimen including chinese herbs[j]. lancet,1993,341(8842):387-391.
[21] chen m,su m,zhao l,et al. metabonomic study of aristolochic acidinduced nephrotoxicity in rats[j]. j proteome res,2006,5(4):995-1002.
[22] 赵剑宇,颜贤忠,彭双清. 关木通肾毒性的代谢组学研究[j]. 中草药,2006,37(5):725-730.
[23] wei l,liao p,wu h,et al. toxicological effects of cinnabar in rats by nmrbased metabolic profiling of urine and serum[j]. toxicol appl pharmacol,2008,227(3):417-429.
[24] wei l,liao p,wu h,et al. metabolic profiling studies on the toxicological effects of realgar in rats by 1hnmr spectroscopy[j]. toxicol appl pharmacol,2009,234(3):314-325.
[25] holmes e,tang h,wang y,et al. the assessment of plant metabolite profiles by nmrbased methodologies[j]. planta med,2006,72(9):771-785.
[26] van der kooy f,maltese f,hae choi y,et al. quality control of herbal material and phytopharmaceuticals with ms and nmr based metabolic fingerprinting[j]. planta med,2009,75(7):763-775.
[27] ma c,wang h,lu x,et al. metabolic fingerprinting investigation of artemisia annua l. in different stages of development by gas chromatography and gas chromatographymass spectrometry[j]. j chromatogr a,2008,1186(1-2):412-419.
[28] tianniam s,tarachiwin l,bamba t,et al. metabolic profiling of angelica acutiloba roots utilizing gas chromatographytimeofflightmass spectrometry for quality assessment based on cultivation area and cultivar via multivariate pattern recognition[j]. j biosci bioeng,2008,105(6):655-659.
[29] chan e c,yap s l,lau a j,et al. ultraperformance liquid chromatography/timeofflight mass spectrometry based metabolomics of raw and steamed panax notoginseng[j]. rapid commun mass spectrom,2007,21(4):519-528.
[30] plumb r s,stumpf c l,granger j h,et al. use of liquid chromatography/timeofflight mass spectrometry and multivariate statistical analysis shows promise for the detection of drug metabolites in biological fluids[j]. rapid commun mass spectrom,2003,17(23):2632-2638.
[31] chen c,gonzalez f j,idle j r. lcmsbased metabolomics in drug metabolism[j]. drug metab rev,2007,39(2-3):581-597.
[32] giri s,idle j r,chen c,et al. a metabolomic approach to the metabolism of the areca nut alkaloids arecoline and arecaidine in the mouse[j]. chem res toxicol,2006,19(6):818-827.
[33] giri s, krausz k w, idle j r, et al. the metabolomics of (+/-)arecoline 1oxide in the mouse and its formation by human flavincontaining monooxygenases[j]. biochem pharmacol,2007,73(4):561-573.
[34] jia w,li h,zhao l,et al. gut microbiota: a potential new territory for drug targeting[j]. nat rev drug discov,2008,7(2):123-129.
[35] xu e y,perlina a,vu h,et al. integrated pathway analysis of rat urine metabolic profiles and kidney transcriptomic profiles to elucidate the systems toxicology of model nephrotoxicants[j]. chem res toxicol,2008,21(8):1548-1561.
[36] jarvis r m,broadhurst d,johnson h,et al. pychem: a multivariate analysis package for python[j]. bioinformatics,2006,22(20):2565-2566.
[37] wishart d s,tzur d,knox c,et al. hmdb: the human metabolome database[j]. nucleic acids res,2007,35(database issue):d521-526.
[38] lindon j c,nicholson j k,holmes e,et al. summary recommendations for standardization and reporting of metabolic analyses[j]. nat biotechnol,2005,23(7):833-838.
[39] kruger n j,troncosoponce m a,ratcliffe r g. 1hnmr metabolite fingerprinting and metabolomic analysis of perchloric acid extracts from plant tissues[j]. nat protoc,2008,3(6):1001-1012.
[40] lisec j,schauer n,kopka j,et al. gas chromatography mass spectrometrybased metabolite profiling in plants[j]. nat protoc,2006,1(1):387-396.
[41] de vos r c,moco s,lommen a,et al. untargeted largescale plant metabolomics using liquid chromatography coupled to mass spectrometry[j]. nat protoc,2007,2(4):778-791.
