eag1钾离子通道在宫颈癌中的表达以及缺氧对其的调控
【关键词】 宫颈癌;钾离子通道;eag1
（本站文章仅给需要的医务工作者提供交流学习参考。翰林医学论文网免费提供。部分资源由工作人员网上搜索整理而成，如果您发现有哪部分资料侵害了您的版权，请速与我们后台工作人员联系，我们将即时删除。客服qq：88970242.后台工作qq：928333977）
【摘要】 目的 研究不同病变宫颈组织中eag1表达情况以及缺氧对宫颈癌hela细胞膜上eag1钾离子通道表达和活性的影响。方法 采用免疫组化法检测不同宫颈组织和宫颈癌hela细胞中eag1蛋白的表达情况;采用rt-pcr法检测不同缺氧时间和缺氧浓度对hela细胞中eag1 mrna表达的影响。采用全细胞膜片钳记录的方法，研究缺氧对eag1钾离子通道活性的影响。结果 宫颈上皮内瘤变组织中eag1蛋白的表达明显高于正常组，宫颈癌组织中eag1的表达明显高于宫颈上皮内瘤变组;eag1的表达随临床分期的增加逐渐增高，eag1的表达与病理分级无明显相关性。正常培养的宫颈癌hela细胞中即有eag1表达;其表达随缺氧程度加深及缺氧时间的延长明显增强。hela细胞中eag1钾离子通道是电压依赖性的，具有延迟整流及不失活特性;轻度缺氧条件能使hela eag1钾离子通道电流强度增大、激活时间缩短。Www.11665.CoM结论 eag1钾离子通道蛋白有可能成为新的早期筛查和判断宫颈癌生物学行为的诊断指标。
【关键词】 宫颈癌;钾离子通道;eag1
expression of eag1 k+ channel in cancer of the cervix and the regulation of hypoxia
lin shuang,li li,liu yuan,et al. department of obstreics and gynecology,daping hospital,the third military medical university,chongqing 400042,china
[abstract] objective immunohistochemistry was employed to detect the expression of eag1 protein in different cervix uteri tissues and cacx hela cells.methods we determined the effect of different hypoxia time and hypoxic concentration on the expression of eag1 mrna in hela cell using rt-pcr. meanwhile, whole cellular patch clamp recording was employed to investigate the effect of hypoxia on activity of eag1 k+ channel.results the expression of eag1 protein in cervical intraepithelial neoplasia (cin) tissue was significantly higher than that in normal control, and the expression in cacx tissue was remarkably higher than that in cin group. the expression of eag1 ascended as the development of clinical stage of cervical cancer, but almost irrelevant to pathological grade. results of immunofluorescence and rt-pcr suggested that the expression of eag1 significantly increased along with the aggravation of hypoxic degree and prolong of hypoxia time. whole cellular patch clamp recording showed that slight anoxia condition could augment cell membrane potential of hela, increase the current intensity of eag1 k+ channel and shorten the activation time.conclusion eag1 k+ channel protein is possible to become diadynamic criteria for new early screening and cacx biological behavioral judgment. meanwhile, eag1 played an important role in hypoxic reception of cacx hela cell.
[key words] cervical cancer; potassium channels; eag1
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，虽然目前诊疗技术有了较大的提高，但仍有30%～40%的患者死于局部复发和远处转移。
研究表明组织缺氧是导致肿瘤发生、发展，最终产生放、化疗抵抗的主要原因之一。最近有关离子通道与低氧适应之间的关系引起了越来越多的注意[1]。目前认为离子通道中最常与细胞增殖和肿瘤相关的是钾通道;其中膜eag1钾离子通道被认为与宫颈癌的相关性最为密切[2]。本研究以不同病变宫颈组织为研究对象，通过免疫组化方法研究eag1钾离子通道在宫颈癌发生、发展过程中的表达情况;以体外培养的人宫颈癌hela细胞为研究对象，观察缺氧对eag1钾离子通道表达及电生理活性的影响，以期为宫颈癌的诊治提供新的途径。
1 资料与方法
1.1 一般资料 标本全部来自第三军医大学第三附属医院妇产科1995年12月-2008年12月诊治的病例，全部标本均经我院病理科诊断并证实，患者年龄24～77岁，平均46岁。
1.2 细胞准备
1.2.1 细胞培养 hela细胞为本室培养的细胞株。使用含10%小牛血清的dmem培养基，置于5%co2、95%空气、37℃、饱和湿度的孵箱内培养。
1.2.2 缺氧模型 观察细胞70%～90%融合，在无菌条件下弃去大部分培养液。将混合气体(含90%n2、5%co2、5%o2)以10l/min流量充入密闭容器，持续20min，同时关闭进气口和出气口，抽取气体经血气分析仪检测容器内o2浓度小于5%。
1.3 eag1表达的检测
1.3.1 免疫组化检测方法 兔抗人eag1单克隆抗体购自sigma公司。组织标本常规石蜡包埋，制成4μm厚切片，常规脱蜡，30%新鲜双氧水灭活内源酶，将切片浸入0.01m枸橼酸盐缓冲液(ph6.0)，微波炉加热至沸后断电,间隔10min重复两次,冷却后0.02m pbs洗涤,抗原修复液修复抗原,山羊血清封闭后不洗,滴加1:150稀释的eag1单克隆抗体,4℃过夜,0.02m pbs洗后加生物素标记羊抗兔二抗,30℃染色20min后,dab显色,苏木素轻度复染,二甲苯透明,封片。显微镜下观察并计数阳性染色细胞数。
1.3.2 判断标准 eag1主要定位于胞浆和(或)胞膜。根据肿瘤细胞显色的比例及染色强度，对eag1表达做半定量评定[3]。按阳性细胞率评分：阳性细胞数占<11%为1分; 11%～50%为2分; 51%～80%为3分;>80%为4分。按显色程度评分:染色弱为1分;中等染色为2分;强染色为3分。然后将两种评分结合起来分为4级:无论染色强度如何,细胞阳性率≤10%为阴性;评2或3分者为弱阳性(+);评4或5分为中度阳性(++);6或7分为强阳性(+++)。若1例标本有2个染色结果,则取1个纳入统计。
1.4 rt-pcr法检测低氧对eag1 mrna表达的影响 trizon试剂盒购自invitrogen 公司，反转录试剂盒购自takara公司。eag1引物为：5'-taatggcttccctctttcatctcct-3';5'-tgttgagactcctccattccttcca-3'(450 bp);β-actin引物为：5'-cacggctgcttccagctcct-'3';5'-ctcctgcttgctgatccacatc-3'(150 bp)。取(0.5～1)×107细胞，按tripil试剂盒说明提取总rna，按反转录试剂盒说明进行逆转录反应，eag1 mrna的pcr反应条件为94℃变性30s，58℃eag1退火30s，72℃ 2min，最后72℃延伸2min。琼脂糖电泳测定eag1 mrna表达，拍照。每组检测6瓶细胞。
1.5 全细胞膜片钳法检测hela细胞缺氧后钾离子通道改变 应用电极拉制器用两步法拉制玻璃毛细管电极。应用axon公司的pclamp软件中的clampex采集数据，采样频率为10khz，滤波频率为1～5khz。pclamp软件输出刺激命令给膜片钳放大器，通过探头、记录电极施加到细胞内，用于钳制细胞膜电位和诱发钾离子通道电流。
1.6 统计学处理 应用spss13.0统计软件对结果进行处理，组间比较采用χ2检验，fisher确切概率法计算p值，膜片钳实验获得的全部数据均用pclampb 9.0(axon ins，usa)软件进行分析处理，计量资料采用t检验和方差分析，p<0.05为差异有显著性，p<0.01表示为差异有非常显著性。
2 结果
2.1 eag1蛋白在不同宫颈病变中的表达
2.1.1 eag1在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤样变及宫颈鳞癌中的表达 eag1在3种组织中均为细胞质、胞膜表达，细胞核未见表达。eag1在慢性宫颈炎及宫颈上皮内瘤变中呈轻度着色，eag1在宫颈鳞癌中呈中强度着色，阳性信号弥漫分布于癌巢内(图1、2、3)。eag1在宫颈鳞癌中的表达率明显高于慢性宫颈炎组和宫颈上皮内瘤样变组，宫颈上皮内瘤样组内eag1表达率明显高于慢性宫颈炎组，差异有显著性(p<0.01)。结果见表1。
2.1.2 eag1在各级宫颈上皮内瘤样变中的表达 由表2可见，eag1在cin各级之中的表达随病变程度的增高逐渐增高，但各组比较差异无显著性(p>0.05)。图1 eag1蛋白在慢性宫颈炎
2.1.3 eag1表达与宫颈癌临床病理学指标的关系 eag1在不同病理分级中的阳性表达率虽然随病变恶性程度的增高逐渐增高，但各组比较差异无显著性(p>0.05)。在不同的临床分期中，ⅰ+ⅱ组eag1表达明显高于0期(p<0.01)，而ⅲ+ⅳ期组eag1表达明显高于ⅰ+ⅱ组和0组(p<0.01)，差异有显著性。结果见表3。表3 eag1表达与宫颈癌临床分期、病理分级的关系注:①g 1 and g2;② g2 and g3;③ g 1 and g3;④ 0 andⅰ+ⅱ;⑤ⅰ+ⅱand ⅲ+ⅳ;⑥ⅲ+ⅳi and ⅰ+ⅱ
2.2 缺氧对eag1 mrna表达的影响 采用rt-pcr法检测了eag1 mrna在不同缺氧条件下宫颈癌hela细胞系的表达情况，给予不同缺氧条件，3h后hela细胞中其mrna的表达水平不尽相同，随缺氧程度的增加呈现先增高后降低的趋势(图4);在5%o2氧浓度条件下，其表达随缺氧时间的增加逐渐增高(图5)。
eag1 mrna水平变化。2.3 在全细胞膜片钳方式下分电流钳和电压钳两种模式分别记录的正常和缺氧后hela细胞膜钾离子电压、电流特性
2.3.1 缺氧对膜k+通道电流幅值的影响 采用电压钳制方式分别给3组细胞施以保持电压(holding potential，hp)，对细胞进行去极化电压钳制，测试电压(test potential，tp)范围为-100～+60 mv，hp=-60 mv时，脉冲阶梯步长为20mv，刺激频率为0.2hz。缺氧组引出15例跨膜k+电流图，随着测试电压的增大，k+电流幅值也增加，具有电压依赖性，在高钳制电压下(+80～+100 mv)k+电流具有失活趋势，膜k+电流具有内向整流特点(图6);缺氧组k+电流峰值明显升高，差异有显著性，缺氧+4-ap组电流幅值的变化则小于单纯缺氧组，如表6、图6所示。表6 不同tp下正常组和缺氧组及缺氧+4-ap组hela膜k+电流幅值比较
2.3.2 缺氧、缺氧+4-ap组和正常组hela细胞激活的时间常数(τ) 用clampfit程序对电流激活时间过程进行拟合，证实可用单指数进行拟合，记录到缺氧、缺氧+4-ap组和正常组hela细胞在不同tp下激活电流曲线的时间常数τ值(见表7)。两两比较：缺氧组与缺氧+4-ap组和正常组比较差异均有显著性(p<0.01)。表7 缺氧、缺氧+4-ap组和正常组hela在不同tp下激活电流曲线时间常数τ值
2.3.3 常氧、缺氧、缺氧+4-ap组hela细胞膜电容与k+通道电流密度 各组分别检测15例，缺氧组细胞膜电容虽大于其他两组，但两两比较差异无显著性(p>0.05);电流密度比较，缺氧组明显高于对照组，缺氧+4-ap组虽有所增高，但仍显著低于单纯缺氧组 (p<0.01)。见表8。表8 细胞膜电容和电流密度的比较 (x±s，n=15)
3 讨论
宫颈癌是妇科三大恶性肿瘤之一。研究发现肿瘤内部乏氧不仅可引起肿瘤的发生、发展，还可引起肿瘤细胞放化疗抵抗，但其具体的缺氧调控机制仍不十分清楚，最近有关离子通道与低氧适应之间的关系引起了越来越多的注意[4]。离子通道中最常与细胞增殖和肿瘤相关的是钾通道;其中膜eag1钾离子通道被认为与宫颈癌的相关性最为密切[5,6]。
eag1钾离子通道是1969年发现的一种新的通道，属电压门控性钾通道，通过去极化而激活。专一分布于大脑，在肌细胞和胎盘中有少量表达[7,8]。eag表达和激活在多种肿瘤细胞株和重要的肿瘤组织中被证实。fatias[9]等通过对6例宫颈癌组织标本和12例正常宫颈组织进行逆转录pcr和southern印迹实验，发现6例宫颈癌标本eag1表达全部为阳性，而正常对照标本的阳性率仅为33%。笔者认为eag1表达的升高可能是肿瘤发展的早期信号，eag1钾离子通道不仅可以作为肿瘤标志物、疾病早期标志，也将成为潜在的宫颈癌治疗靶点。faris等[10]的研究也有相似发现，他们认为eag1钾离子通道的表达与否及其通道活性大小对癌细胞的增殖非常重要，认为其可能成为潜在的宫颈癌细胞膜上的治疗靶点，但是上述研究均未从eag1的表达情况与宫颈癌临床分期、病理组织类型等方面进行分析。
笔者在应用figo分期的基础上，采用免疫组化法检测不同宫颈组织中eag1蛋白的表达，结果显示，在宫颈上皮内瘤变组织中eag1的表达明显高于正常组，而宫颈癌组织中eag1的表达又明显高于宫颈上皮内瘤变组，eag1表达随临床分期升高显著增高，说明在宫颈癌的生长过程中，eag1钾离子通道与肿瘤的发生、发展相关。并且随着肿瘤向深层生长，eag1表达水平更高，推测肿瘤生长过速，缺氧加重，激活更多的基因表达，更加增加它在胞内的水平。本实验结果显示，eag1的表达水平随病理分级的升高而升高，但各组间比较差异无显著性，分析其原因，考虑为不同病理分级的肿瘤组织中均有不同程度的低氧区域所致。笔者随后进行的rt-pcr实验结果也显示，在正常培养的hela细胞内可以检测到eag1mrna表达。
随着对eag1结构和功能的深入研究，发现eag1通道形成的四聚体中，每一个单体有六个假定的主要包含电压传感蛋白的跨膜区(富含正电荷氨基酸)，并且它的细胞内侧端有一个per-arnt-sim(pas)区即为氧感受器，它可根据氧分压(partial pressure of oxygen，po2)的变化调节自身电导系数，推测其与肿瘤乏氧有关[11,12]。
那么宫颈癌细胞上的eag1钾通道是否参与了缺氧信号的调节?笔者采用rt-pcr法检测不同氧浓度下hela细胞内eag1 mrna水平情况，发现随氧浓度的降低，eag1 mrna水平呈先升高后降低的趋势，轻度缺氧条件下，缺氧作用0.5h时细胞内eag1 mrna水平即开始升高，3h后达高峰，6h后尽管有所减弱，但仍强于常氧条件下，提示随缺氧程度加深及时间的延长，eag1 mrna水平明显增强。
由于eag1钾通道具有特定的电压依赖性和药理特点，因此可以根据eag1电生理指纹采用全细胞膜片钳方法测定eag1电流。实验采用自制的通气系统在细胞灌流液中预先持续通以90%n2+5%co2+5%o2的混合气体至少20min，以驱除灌流液中所溶解的氧气，制造缺氧模型。
本文实验结果表明，缺氧组记录到的k+电流幅度及电流强度均明显高于常氧组(p<0.01)，说明缺氧状态下钾离子通道易于开放，开放幅度更大。经clampfit软件拟合后可以得到通道的激活时间常数。本文的结果表明电压钳下缺氧组钾通道激活常数τ值均明显低于常氧组的τ值(p<0.01)，而钾离子通道阻断剂组则无明显变化，这说明缺氧组钾离子通道的k+电流较常氧组达到最大电流振幅所需要时间更短，k+通道开放速度更快，活动增强，钾离子通道阻断剂则可以减弱上述变化。缺氧条件下给予钾通道阻断剂虽能阻断大部分电流，但不能完全抑制该电流，考虑原因可能是由于缺氧条件下细胞内eag1的表达及活性的增高，抑制剂不能有效的抑制其活性，仍表现出钾通道的开放作用;或者hela细胞膜上还存在其他类型的钾离子通道，其电流特性与本文研究的不同，实验中所用的阻断剂不能完全阻断其电流所致，但在缺氧条件下其改变不起主要作用。
上述结果提示，eag1钾离子通道可以作为一种重要的缺氧感受器，在宫颈癌的发生、发展过程中起重要的作用，但具体的缺氧信息传递机制仍需进一步研究。
【参考文献】
1 kung a, zabludoff s, france d, et al. small molecule blockade of transcriptional coactivation of the hypoxia-inducible factor pathway.cancer cell, 2004, 6(1):33-43.
2 swinson de, jones jl, cox g, et al. hypoxia-inducible factor-1 alpha in non small cell lung cancer: relation to growth factor, protease and apoptosis pathways. int j cancer, 2004, 111(1):43-50.
3 zhong h, semenza gl, simons jw, et al. up-regulation of hypoxia-inducible factor 1alpha is an early event in prostate carcinoma. cancer detect prev, 2004, 28(2):88-93.
4 ousingsawat j, spitzner m, puntheeranurak s,et al. expression of voltagegated potassium channels in human and mouse colonic carcinoma. clin cancer res，2007，13(2): 824-831.
5 mello f, suarez-kurtz g, stuhmer w, et al. ether a go-go potassium channel expression in soft tissue sarcoma patients. mol cancer, 2006, 5(1)：42-47.
6 chauhan-palet r, spruce a.characterization of single inward rectifier potassium channels from embryonic xenopus leavis myocytes. j membrane biol, 158(2):265– 274.
7 lang f, foller m, lang ks, et al. ion channels in cell proliferation and apoptotic cell death. j membr biol, 2005, 205(31): 147-157.
8 holl v, coelho d, weltin d, et al.exvivo determination of the effect of whole-body exposure to fast neutrons on murine spleen cell viability and apoptosis. radiat res, 2000, 154(3): 301-306.
9 fatias l, deysi b, lorenza d, et al. ether a` go-go potassium channels as human cervical cancer markers. cancer res, 2004, 64(1)：6996-7001.
10 faris l, ocana d, diaz l, et al. overexpression of eag1 potassium channels in clinical tumours. mol cancer,2006, 5(19): 596-602.
11 denicourt n, cai s, garneau l, et al.evidence from incorporation experiments for an anionic channel of small conductance at the apical membrane of the rabbit distal tubule.biochim biophys acta,128(5):155–166.
12 diaz m, sepulveda fv.characterization of ca2+-dependent inwardly rectifying k+ currents in hela cells. pfluegers arch,1995，430(1):168-180.
