作者：危智盛，王晓辉，洪铭范，苏全喜，余青云，臧林泉，潘雪刁
【摘要】 目的 研究不同剂量甲泼尼龙(mp)作用于实验性变态反应性脑脊髓炎(eae)大鼠模型后，剪接因子srp30c的表达及其与疗效的关系，探讨mp治疗作用及发生激素抵抗的可能机制。方法 构建wistar大鼠eae模型，将eae大鼠分成大剂量组、小剂量组、模型对照组，分别通过尾静脉注射mp 100 mg/kg、25 mg/kg、等容量生理盐水;另取未造模大鼠作为正常对照组，予等容量生理盐水注射。给药5d后处死大鼠，提取新鲜脊髓组织行rtpcr，检测srp30c mrna表达，分析其与疗效的关系。结果 srp30c在各组均有表达，大、小剂量组srp30c mrna表达明显高于模型组、正常对照组，差异有显著性;不同大鼠kono评分改善的差值与其srp30c mrna表达值呈负相关(r=-0.583，p<0.05)。结论 srp30c表达与病情及mp剂量无直接关系，但与疗效呈负相关，表明其与糖皮质激素敏感性下降有着密切的关系，eae模型发生激素抵抗的机制中srp30c扮演着重要的角色。
【关键词】 甲泼尼龙 实验性变态反应性脑脊髓炎 糖皮质激素抵抗 srp30c
abstract:objective to investigate the expression of alternative splicing factor srp30c and the therapeutic effect of methylprednisolone (mp) and the correlation between srp30c and the therapeutic effect in experimental allergic encephalomyelitis (eae) in rats after treatment with mp at different doses,and to explore the possible mechanisms of glucocorticoid resistance. methods established eae model with wistar rats and the animal model were divided into three groups (highdose group,lowdose group,and model control group). highdose group and lowdose group were treated by intravenous injection mp through caudal vein at the doses of 100 mg/kg and 25 mg/kg respectively. model control group and another normal control group were administered with normal saline at the same volume. the rats were executed after 5day therapy,then the spinal cord was extracted and used to detect the expression of srp30c mrna by reverse transcription polymerase chain reaction. the relationship between srp30c and the therapeutic effect was studied. results srp30c was expressed in every group. the expression level of highdose group and lowdose group were significant higher than that of model and normal control group. there was linear correlation between the expression of srp30c mrna and the gn score changes (r=-0.583，p<0.05). conclusion there was neither direct correlation between the expression of srp30c and pathogenesis,nor the dose of mp. while it had a negative correlation between srp30c and therapeutic effect. therefore,it suggested that srp30c contributed to the declining sensitivity of glucocorticoid,and it might play an important role in the mechanisms of glucocorticoid resistance in eae.
key words:methylprednisolone;experimental allergic encephalomyelitis;glucocorticoid resistant;srp30c
多发性硬化(multiple sclerosis，ms)是一种常见的中枢神经系统白质脱髓鞘病变，临床对于ms急性发作和复发常首选甲泼尼龙(methylprednisolone，mp)冲击治疗。Www.11665.com然而，mp使用的剂量一直存在争议，现常用的有500，1 000，2 000 mg/d。超大剂量能否提高疗效及有无诱导糖皮质激素(glucocorticoid，gc)抵抗，引起临床关注。糖皮质激素抵抗(glucocorticoid resistant)发生机制非常复杂，其中剪接因子家族中srp30c与激素抵抗密切相关[1，2]。本研究通过对实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis，eae)大鼠模型mp治疗后神经组织中srp30c mrna表达情况进行分析，探讨mp治疗作用及ms发生激素抵抗的可能机制。
广东药学院学报 第25卷 第3期 危智盛，等.甲泼尼龙对实验性变态反应性脑脊髓炎大鼠srp30c的影响1 材料与方法
1.1 实验材料
wistar雌性大鼠，体质量180～200 g;豚鼠，体质量350～400 g，均购自南方医科大学实验动物中心(许可证号：scxk粤20060015);不完全弗氏佐剂购自sigma公司;卡介苗冻干粉、百日咳菌液购自中国药品生物制品检定所;总rna提取试剂trizol reagent(invitrogen公司);逆转录试剂盒(toyobo公司);甲泼尼龙(pfizer manufacturing belgium nv公司)。
1.2 eae模型制备[3]
以豚鼠全脊髓制成无黏性50%(v∶v)髓鞘碱性蛋白(mbp)生理盐水匀浆。将卡介苗冻干粉与不完全弗氏佐剂混匀，配成卡介苗浓度为4 mg/ml的完全弗氏佐剂。再将mbp匀浆与等体积的完全福氏佐剂混合，反复抽打成油包水样，制成抗原乳剂。戊巴比妥钠腹腔麻醉wistar大鼠后在大鼠四肢足垫分别注入抗原乳剂共0.4 ml，并在大鼠左后肢足背皮下注射0.1 ml百日咳菌液(约含3×109个菌体)。免疫接种后每天观察大鼠反应、进食、体质量、行动等情况。依据kono[4]标准对神经损害症状进行评估：正常或无任何神经缺损症状，记0分;i级：尾部肌张力消失，可见轻度步态笨拙，记1分;ⅱ级：尾部无力，双后肢肌张力低，记2分;ⅲ级：尾部无力，双后肢瘫痪，但给予刺激后可挪动，记3分;iv级：瘫痪累及前肢，伴尿便失禁，记4分;v级：濒死状态或死亡，记5分。症状介于两标准级之间以±0.5分记。
1.3 实验分组及给药
eae发病大鼠随机分成3组，分别为：①大剂量组8只，予mp 100 mg/kg;②小剂量组8只，予mp 25 mg/kg;③模型对照组7只，予等容量生理盐水;另取5只未经造模的wistar大鼠同等条件下饲养作为正常对照组，予等容量生理盐水。造模后第12天，大鼠发病达高峰时开始给药。mp以生理盐水稀释后自尾静脉缓慢注入，每日给药1次，连续3 d后均减半量再给药2 d，共给药5次。
1.4 组织取材
各组给药5 d后，于第6天进行评分后处死，取大鼠部分新鲜脊髓组织置液氮保存，备作总rna提取。另取大脑视交叉层面2 mm脑组织、小脑、脑干、脊髓颈膨大、腰膨大部分4%多聚甲醛固定做常规石蜡包埋、切片、he染色，光镜下观察脑、脊髓组织的形态学变化。
1.5 rtpcr
新鲜脊髓组织研磨制成trizol匀浆，异硫氰酸胍苯酚氯仿一步法提取总rna,紫外分光光度法测定rna的量和纯度。cdna合成及pcr扩增反应体系均按试剂盒说明进行。引物由invitrogen公司合成，srp30c引物序列：sense:5′ttctaa acacagtgggcgactc3′,antisense:5′tacgtaatt tcgaccagagcca3′, 产物199 bp; 内参 g3pdh序列：sense:5′accacagtccatgccatcac3′,antisense:5′tccaccaccctgttgctgta3′，产物450 bp。pcr产物与loading buffer混合后进行2%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射分析仪观察后成像，qantity one凝胶图像分析系统测定srp30c及g3pdh的吸光度，计算srp30c/g3pdh值，作为srp30c mrna的表达水平。
1.6 统计学处理
采用spss13.0统计软件进行分析，首先对数据做正态性检验，计量资料以±s表示。若符合正态分布，两组间用t检验;多组间参数比较采用单因素方差分析;多组均数两两比较采用lsdt检验分析;相关关系采用pearson相关分析。
2 结 果
2.1 eae大鼠发病情况
免疫诱导后，大鼠于第10天始先后发病，表现为体质量进行性下降、尾巴张力减退，继之尾巴无力，并发展为后肢及四肢无力、麻痹、大小便失禁。kono评分1分以上即为发病。eae大鼠脑、脊髓组织he染色光镜下可见小血管充血、管壁增厚、内皮细胞有破坏、血管周围大量炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主，并在小血管周围形成典型的“袖套样(cuffing)”改变。而正常对照组大鼠脑和脊髓均未见异常。
2.2 各组大鼠治疗前后评价
大剂量组及小剂量组eae大鼠经mp治疗后神经损害表现明显改善，而模型对照组大鼠症状无改善。治疗组kono评分总体下降，而模型组评分增高(图1)。大剂量组与小剂量组给药前后评分改变的差值差异无显著性(p>0.05)。见表1。
2.3 srp30c mrna表达结果
各组大鼠脊髓组织均可检测到srp30c mrna表达，见表2，图2。大剂量组与小剂量组srp30c mrna表达差异无显著性(p>0.05);模型对照组与正常对照组间差异无显著性(p>0.05);而大剂量组、小剂量组srp30c mrna表达高于模型对照组、正常对照组，差异有显著(p<0.01或p<0.05)表1 eae大鼠给药前后kono评分情况与治疗前比较：▲p<0.01，*p<0.05;与模型对照组比较：#p<0.01表2 各组大鼠srp30c mrna的表达
2.4 srp30c mrna表达与神经损害评分改善相关性分析
经mp治疗后的大鼠症状评分均有不同程度的改善，对大鼠治疗前后kono评分改善的差值与其srp30c mrna表达值进行相关性分析，r=-0.583，p<0.05，见图3，两者呈负相关，表明srp30c mrna的表达值越高，疗效越低。
3 讨 论
eae病理改变和临床表现与ms极为相似，是国内外公认的研究人类ms发病机制及实验治疗的最适宜模型[5]。糖皮质激素可以通过诱导t细胞凋亡及下调t细胞黏附分子等机制达到治疗eae的作用[6]。构建wistar大鼠eae模型，并予不同剂量mp治疗，大鼠神经损害表现明显得到改善，治疗后kono评分降低;而模型对照组病情无改善，kono评分升高。证明糖皮质激素治疗eae能达到缓解症状，缩短病程的作用。通过比较大剂量组和小剂量组各大鼠评分改善的程度，得出两组间差异无显著性，因此还不足以说明增大mp剂量能提高疗效。本实验样本量不够大，另外大鼠对药物剂量的耐受范围大等因素可能影响结果的评价。是否疗效与剂量存在一定关系还有待继续探讨。
gc是ms急性发作和复发治疗的主要药物，大剂量静脉mp冲击治疗与大剂量强的松口服治疗均能达到类似的疗效[7]。然而大剂量gc的使用，可诱导患者对激素的敏感性下降，甚至出现gc抵抗的可能。而gc抵抗机制非常复杂，在不同的疾病、不同的病人中其发生机制也不尽相同。目前，国内外已有大量研究表明糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor，gr)的2种亚型：grα及grβ，其比例失常与gc抵抗关系密切。grα表达量的减少或grβ表达量的增多，或者两者同时发生变化，均会导致grα/grβ比例的改变，高比例与gc敏感有关，而低比例则常发生gc抵抗[8]。grβ是在gr前体mrna的选择性剪接过程中形成的。剪接因子srp30c是富含丝氨酸/精氨酸蛋白家族(serine/argininerich protein，srp)成员之一，其在促进gr premrna发生选择性剪接形成grβ mrna的过程中发挥着重要作用。xu[9]等研究表明srp30c与中性粒细胞中的grβ表达水平密切相关。杨昊[1]、李居一[2]等对激素抵抗型和激素敏感型哮喘、系统性红斑狼疮、肾病综合征等患者的pbmc中srp30c mrna的表达进行研究，进一步证实了其与grβ以及gc抵抗之间的关系。目前，国内外尚未见ms患者或eae模型中srp30c与激素抵抗关系的相关报道。
通过对各组脊髓组织srp30c mrna半定量分析发现，未使用mp的模型组与正常对照组之间srp30c mrna表达无差异，说明srp30c mrna表达与病情无关。而使用过mp的大剂量组和小剂量组srp30c mrna表达均高于模型对照组和正常对照组。推断srp30c mrna表达在一定程度的增高预示着皮质激素治疗后有发生gc抵抗的可能。研究发现，治疗组各大鼠kono评分改善的差值与其srp30c mrna表达呈负相关，提示srp30c mrna表达与mp疗效呈负相关，进一步证明其与gc敏感性下降有着密切的关系。eae模型发生gc抵抗的机制中srp30c可能扮演着重要的角色，推断srp30c也与ms患者发生激素抵抗有着密切的关系。
【参考文献】
[1] 杨昊，刘荣玉. 糖皮质激素敏感型与抵抗型患者grα、grβ及srp30c mrna表达水平[j].中华内科杂志，2006,45(3):223-224.
[2] 李居一，徐建华. 糖皮质激素受体α,β 和剪接因子srp30c在系统性红斑狼疮的表达及意义[j].中华风湿病学杂志，2007,11(5):262-266.
[3] 徐玉，刘瑞春，王颖，等. wistar大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎模型的建立[j]. 脑与神经疾病杂志，2007，15(6):415-417.
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[9] xu q,leung dy,kisich ko. serineargininerich protein p30 directs alternative splicing of glucocorticoid receptor premrna to glucocorticoid receptor beta in neutrophils[j]. j biol chem,2003,278(29):27112-27118.
