摘要】 目的 观察虚寒状态下大鼠血浆第二信使环磷酸腺苷(camp)含量变化,探讨其可能机制。方法 将大鼠随机分为正常组和虚寒模型组,虚寒组每日肌肉注射氢化可的松注射液,正常组每日肌肉注射等量生理盐水,持续14 d;处死动物,检测甲状腺激素三碘甲腺原氨酸(t3)、甲状腺素(t4)、反三碘甲腺原氨酸(rt3)、肾上腺皮质激素皮质醇(cor)、环磷酸腺苷(camp)、环磷酸鸟苷(cgmp)、腺苷酸环化酶(ac)、三磷酸腺苷(atp)。结果 虚寒状态内分泌激素t3、t4、rt3、cor水平降低,camp水平、ac活性降低,atp含量升高。结论 虚寒状态下甲状腺、肾上腺皮质功能降低,内分泌激素作用于ac,对ac活化降低,第二信使camp生成减少,其介导的生物学效应相应降低,故虚寒机体表现出抑制的状态。
【关键词】 虚寒状态;环磷酸腺苷;腺苷酸环化酶;三磷酸腺苷;内分泌激素;大鼠
experimental study on the potential changing mechanism of camp in asthenia cold syndrome rats li min, zhang bing, liu xiao-qing, et al (pharmacy college, beijing university of tcm, beijing 100102, china)
abstract：objective to investigate the change of endocrine, camp and potential mechanism in asthenia cold syndrome rats. method the rats were randomly divided into normal group and asthenia cold model group. the model group were treated with intramuscular injection of hydrocortisone for 14 days, and the normal group with ns. the content of cyclic adenosine monophosphate (camp) and adenylate cyclase (ac), triiodothyronine (t3), thyroxine (t4), dopamine (rt3), cortisol (cor), cyclic guanosine monophosphate (cgmp) was detected by radioimmunoassay (ria). the content of adenosine triphosphate (atp) was detected by chemiluminescence. result the content of t3, t4, rt3, cor, camp were decreased, the activity of ac was decreased, the conent of atp was increased. conclution the function of the endocrine system was suppressed in asthenia cold rats, which can down-regulate camp and lead to asthenia cold syndrome.
key words：asthenia cold syndrome;camp;ac;atp;endocrine hormone;rat
环磷酸腺苷(camp)是机体内重要的第二信使,参与和调节机体神经递质传递、基因表达、激素调节、免疫反应以及细胞增殖和分化等生理及病理作用。wWW.11665.coM腺苷酸环化酶(ac)催化三磷酸腺苷(atp)脱去一个焦磷酸而生成camp,生成的camp通过激活蛋白激酶a(pka)使靶细胞蛋白磷酸化,产生生物学效应[1]。美国生物学家goldberg在20世纪70年代初曾提出细胞功能调节的“阴阳学说”,他认为camp与环磷酸鸟苷(cgmp)通常呈拮抗性共同参与细胞反应的调节。相关研究结果表明,虚寒状态下,血浆中camp含量降低,虚热状态下,血浆中camp含量升高。本实验观察虚寒状态下camp生成的关键酶ac活性及前体物质atp的水平变化,探讨虚寒状态下camp变化的内在机制,明确第二信使camp变化规律,为研究虚寒状态的生理病理现象提供基础。
1 实验材料
1.1 动物
spf级雄性sd大鼠100只,体重(250±10)g,北京维通利华实验动物有限公司提供,合格证号：scxk(京)2002-2003。
1.2 药物与试剂
氢化可的松注射液,规格：5 mg/ml,批号0805031,郑州羚锐制药有限公司生产。乙二氨四乙酸钠(edta-na2),amresco提供。荧光素-荧光素酶缓冲液(50 mmol/l甘氨酰甘氨酸,10 mmol/l mgso4,1 mmol/l edta,1 mg/ml牛血清白蛋白),ph 7.6,使用前以1 mg/ml的量加入荧光素-荧光素酶,混匀。10 mmol/l tris-hcl缓冲液,ph 7.6。atp储存液：精密称取atp 3 mg溶于10 ml tris-hcl缓冲液中。atp应用液：实验前取储存液配制成30 μl/ml的含量,冰浴使用,现用现配。camp、cgmp试剂盒,购自上海中医药大学同位素室;肾上腺皮质激素皮质醇(cor)、三碘甲腺原氨酸(t3)、甲状腺素(t4)、反三碘甲腺原氨酸(rt3)试剂盒,北京北方生物技术研究所提供。
1.3 仪器
贝克曼cx4型全自动生化分析仪;shimadzu uv-120-02紫外可见分光光度计,型号752,上海光谱仪器有限公司;低温高速离心机,日本hitachi公司;电子精密天平,型号eb- 280-22,日本corporation公司;瑞典1250luminometer发光仪。
2 实验方法
2.1 分组、给药及造模
大鼠适应性喂养3 d后,按体重随机分为模型虚寒组(模型组)及正常组,每组10只。参考文献[2]及前期实验,模型组以氢化可的松[2.5 mg/(kg·d)]肌肉注射给药,连续给药14 d,正常组注射灭菌生理盐水(0.2 ml/只)。造模前测量各组动物的体重、饮食量、饮水量,每日观察并记录动物的一般状态。造模结束后处死动物,取血、取材,3 000 r/min离心15 min,分离血浆(edta-na2抗凝)和血清,全血检测相应指标。
2.2 腺苷酸环化酶活性测定
参照文献[3]。主要操作步骤为：取一定量肝组织,加入预冷的tris-马来酸缓冲液(含4.5 mmol/l mgso4,ph 7.5),在冰水浴中制成10%肝匀浆,取匀浆10 μl加50 μl tris-马来酸缓冲液,l0 mmol/l apt,在30 ℃水浴中温育15 min,然后煮沸3 min以终止反应,反应液以3 000 r/min离心15 min,取上清液,测反应产物camp的含量,并以此计算出ac的活性。酶的活性单位以每15 min camp pmol/mg蛋白表示,组织匀浆蛋白质含量用考马斯亮蓝法测定。
2.3 三磷酸腺苷检测
参照文献[4]加以改进,用化学发光法测定动物血清中atp的含量。具体步骤如下：准确吸取100 μl虫荧光素-荧光素酶溶液转移到反应管中,然后取离心后血清20 μl加入反应管中,将反应管放入暗室中,用光度计检测反应40 s时的发光值。
2.4 环磷酸腺苷、环磷酸鸟苷、肾上腺皮质激素皮质醇、三碘甲腺原氨酸、甲状腺素、反三碘甲腺原氨酸测定
采用放射免疫法,操作按试剂盒说明书进行。
3 统计学方法
结果采用sas8.2统计软件包进行统计学分析,实验数据均以x±s表示,组间比较采用t检验。
4 结果
4.1 动物一般生理表现
与正常组比较,模型组出现毛色枯槁、少动、喜欢扎堆并挤卧在一起、大便溏稀、对抓取的抵抗力减弱等表现。
4.2 内分泌激素变化(见表1)表1 氢化可的松模型大鼠t3、t4、rt3、cor的变化注：与正常组比较,*p<0.05,**p<0.01(下同)
4.3 环核苷酸变化(见表2、表3)表2 氢化可的松模型大鼠camp、cgmp、camp/cgmp的变化表3 氢化可的松模型大鼠ac、atp的变化(x±s)
5 讨论
虚寒状态是机体常见的病理状态,是临床诊治的基础。虚寒状态通常表现为机体整体功能低下,前期临床及研究表明,虚寒状态时机体内分泌功能低下,具体表现为甲状腺、肾上腺等功能低下及环核苷酸(包括camp和cgmp)等的改变。
本实验结果表明,在肌肉注射氢化可的松2.5 mg/(kg·d) 14 d时模型大鼠出现毛色枯槁、少动、喜欢扎堆并挤卧在一起、大便溏稀、对抓取的抵抗力减弱等表现,同时甲状腺激素、肾上腺皮质激素降低,camp水平降低,camp/cgmp降低。
camp作为机体内最普遍的第二信使,介导神经递质、内分泌激素等进行信号转导,发挥其生物学效应。camp的配基就包括多肽类激素,对机体甲状腺激素、肾上腺皮质激素有一定的调节作用。因此,考虑虚寒状态中甲状腺激素、肾上腺皮质激素的改变与camp有关,故考察与camp生成密切相关的ac、atp,探讨虚寒状态下内分泌激素与camp改变的相关性。
实验结果显示,与正常组比,虚寒状态大鼠甲状腺激素t3、t4、rt3及肾上腺激素cor水平降低,ac活性明显降低;atp含量明显升高,同时camp含量明显降低。说明虚寒状态下,由于ac活性降低,则camp前体物质atp转化为camp减少,atp含量升高。考虑虚寒状态下,由于内分泌激素水平改变,可能作用于ac,使第二信使camp含量降低,其介导的生物学效应相应降低,故虚寒机体表现出抑制的状态。虚寒状态还有神经递质含量改变的表现,ne、da等含量降低[5],ne、da等单胺类神经递质也主要通过camp发挥生物学效应。推测虚寒状态下,机体多种神经内分泌改变通过camp信号转导途径发挥生物学效应。虚寒状态下药物作用效应也表现一定的差异,可能由于此时药物代谢酶水平的改变[6],而camp信号转导途径又可以调节体内重要代谢酶cyp3a的表达[7],因此,camp信号转导途径介导机体代谢水平影响药物功效,可能是虚寒状态的内在分子生物学机制之一。其具体的机制还需进一步探讨。
【参考文献】
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