摘要】 目的 观察中药菟箭合剂含药血清对高糖条件培养的大鼠系膜细胞(mc)磷酸化akt和pten的作用。方法 将大鼠肾小球系膜细胞分为正常对照组、高糖条件培养组和高糖条件培养+4个不同浓度菟箭合剂含药血清组,不同条件培养液培养72 h后用双夹心elisa法检测细胞内磷酸化akt(thr308)和磷酸化pten(ser380)含量。结果 高糖组mc磷酸化akt(thr308)水平显著高于正常对照组(p<0.01),菟箭合剂含药血清干预的mc磷酸化akt水平显著低于高糖组(p<0.01),且有明显的量效关系。高糖组mc磷酸化pten(ser380)水平显著低于正常组mc(p<0.01),各种浓度菟箭合剂含药血清组pten水平均高于高糖组,且呈现量效关系。结论 中药菟箭合剂具有提高高糖培养的mc细胞内pten水平,抑制akt激活的作用。
【关键词】 菟箭合剂;肾小球系膜细胞;糖尿病肾病;磷脂酰肌醇3-激酶-akt信号通路;pten
seropharmacological effect of tujian mixture on phospho-akt and pten of glomerular mesangial cell cultured in high concentrations of glucose yin de-hai1, liang xiao-chun1, zhang hong2, et al (1.peking union medical college hospital, beijing 100730, china;2.institute of basic medical science, chinese academy of medical sciences, beijing 100730, china)
abstract：objective to observe the effects of serum containing the medicine of tujian mixture on phospho-akt and phospho-pten of glomerular mesangial cell (mc) cultured in high concentrations of glucose. method the glomerular mesangial cells from sd rat were divided into six groups：the normal control group, the group of mc cultured in high concentrations of glucose, and four other groups cultured in high concentrations of glucose + different concentrations of rat’s serum containing tujian mixture. after 72 hours, the content level of phospho-akt (thr308) and phospho-pten (ser380) in mc was detected by using sandwich elisa. results the level of phospho-akt (thr308) in the group of mc cultured in high concentrations of glucose was significant higher than that in the normal control group (p<0.01). the level of phospho-akt (thr308) in the groups with serum containing tujian mixture was significant lower than that in the group of mc cultured in high concentrations of glucose (p<0.01). the effects indicated a remarkable change with different dosage of tujian mixture. furthermore, the level of phosphated pten (ser380) in the group of mc cultured in high concentrations of glucose was significant lower than that in the normal control group (p<0.01). the level of phosphated pten in the groups with serum containing tujian mixture was significant higher than that in the group of mc cultured in high concentrations of glucose (p<0.01). the effects also indicated a relationship with the dosage of tujian mixture. conclusion chinese herbal medicine tujian mixture can increase the level of phosphated pten and inhibit activation of akt in cultured mc in high concentrations of glucose.
key words：tujian mixture;glomerular mesangial cell;diabetic nephropathy;pi3k-akt signaling pathyway;pten
糖尿病肾病最为关键的病理改变是肾小球细胞外基质(ecm)的逐渐堆积,最终导致肾小球的硬化。wWw.11665.COm肾小球系膜细胞(mc)发生表型转化,由静止表型转化为增殖/分泌表型,细胞肥大,大量分泌ecm,同时基质蛋白的降解减少是造成肾小球ecm堆积的原因。我们既往的研究发现,中药菟箭合剂可以减少糖尿病大鼠mc的表型转化,减轻肾小球系膜区ecm的堆积,显著降低糖尿病大鼠尿蛋白的排泄量[1]。有研究发现,磷脂酰肌醇3-激酶(pi3k)-akt信号通路异常激活是糖尿病肾病mc细胞肥大、ecm异常分泌重要机制[2],本研究观察了菟箭合剂含药血清对高糖条件培养的mc磷酸化akt和pi3k/akt的抑制物类脂磷酸酶pten影响。
1 材料与方法
1.1 菟箭合剂含药血清的制备
正常sd大鼠,体重250～280 g,购自北京大学医学部实验动物科学部,许可证号：skxk(京)2006-0008。适应性喂养3 d后按每100 g体重2 ml的剂量灌胃菟箭合剂口服液(菟丝子、鬼箭羽和汉防己,三药比例为1∶3∶1,中药饮片购自北京同仁堂药店,水煎制成口服液,每1 ml含原药材1 g),每日灌胃2次,连续3 d,末次灌胃后2 h进行麻醉(12%乌拉坦,每100 g体重1 ml腹膜内注射),颈动脉插管取血,3 000 r/min离心10 min取血清,5 ml分装,-20 ℃保存待用。正常sd大鼠血清的制备除按每100 g体重灌胃自来水2 ml外,其余同含药血清的制备。
1.2 大鼠系膜细胞的培养及分组
sd大鼠(体重100～120 g)按经典方法培养、鉴定大鼠肾小球mc[3]。取第4代细胞用于本实验。从培养瓶中消化mc,制成1×106/ml浓度的细胞悬液,接种于10 cm直径的培养皿中,每个培养皿接种5 ml细胞悬液,加完全rpmi 1640培养液(含20%胎牛血清,l-谷氨酰胺2 mmol/l,青霉素100 u/ml,链霉素100 u/ml,丙酮酸钠2 mmol/l,胰岛素0.6 u/ml,hepes 12.5 mmol/l)至15 ml/皿,置培养箱中(37 ℃、5%co2)孵育,24 h细胞贴壁良好后换不含胎牛血清的培养液静置24 h。将培养液中胎牛血清换为不同条件大鼠血清,分为6组：正常对照组(5 mmol/l葡萄糖,20%正常大鼠血清),高糖组(30 mmol/l葡萄糖,20%正常大鼠血清),高糖+1倍含药血清组(30 mmol/l葡萄糖,20%含药大鼠血清),高糖+4倍稀释含药血清组(30 mmol/l葡萄糖,20%用4倍正常大鼠血清稀释的含药大鼠血清),高糖+8倍稀释含药血清组(30 mmol/l葡萄糖,20%用8倍正常大鼠血清稀释的含药大鼠血清),高糖+16倍稀释含药血清组(30 mmol/l葡萄糖,20%用16倍正常大鼠血清稀释的含药大鼠血清)。
1.3 系膜细胞磷酸化akt和pten的检测
使用cell signaling公司的磷酸化akt(thr308)和磷酸化pten(ser380)双夹心elisa试剂盒检测。按其操作说明书进行：加入不同处理因素培养液培养大鼠mc 72 h后,弃培养液,4 ℃下pbs冲洗细胞,每一培养皿(10 cm直径)加0.5 ml细胞溶解液,刮下细胞,移至试管中,4 ℃微量离心取上清液即是细胞溶解液,以一次使用的样品量储存于-80 ℃待用。检测时用样品稀释液稀释细胞溶解液至适合的倍数,根据预实验结果最终样品稀释倍数磷酸化akt为1倍稀释液稀释、磷酸化pten为8倍稀释液稀释。加100 μl稀释后的细胞溶液至相应的微孔中,按操作说明书依次完成加一抗、hrp连接二抗、tmb底物、终止液等操作步骤,最后用酶标仪以450 nm波长读取样品吸光值。
1.4 统计学方法
应用spss13.0统计软件进行统计学分析,各组间均数比较采用方差分析。
2 结果
(见表1)表1 各组mc磷酸化akt和磷酸化pten的比较注：与正常对照组比较,▲▲p<0.01;与高糖组比较,*p<0.05,**p<0.01
3 讨论
肾小球mc的肥大和ecm合成的增多等细胞表型和功能的改变是糖尿病肾病病理变化的基础[4],导致mc表型和功能改变的机制目前并不完全清楚,可能是多种因素共同作用的结果。pi3k-akt信号通路在调控细胞的增殖、分化、凋亡中起关键作用,pi3k-akt通路由胰岛素和多种细胞因子受体激活,引发在pi3k作用下的第二信使三磷酸磷脂酰肌醇(pip3)的堆积,进而引发akt在308位苏氨酸和407位丝氨酸的磷酸化,磷酸化akt进而诱发一系列细胞下游事件,促进细胞的存活、增殖与分化,阻断细胞的凋亡。pten是细胞内pi3k/akt信号通路的主要负调节物,通过催化pip3的3位磷酸基团脱磷酸,使pip3形成pip2,降低了pip3水平,从而阻断pi3k/akt信号通路。有研究发现,糖尿病大鼠肾小球内pten表达显著减少、akt活性升高,通过重组pten腺病毒转染肾小球mc使其过度表达pten,可抑制高糖诱导的mc肥大[2],提示糖尿病肾病时mc表型和功能的改变可能与pi3k-akt信号通路的异常(pten表达的降低、akt的异常激活)有关。
pi3k-akt信号通路的调控是一个非常复杂的过程,包括胰岛素受体、受体酪氨酸激酶、整合素受体、多种细胞因子受体、g蛋白耦联受体均与pi3k-akt信号通路的激活有关。糖尿病肾病时存在多种以上受体激活的因素,因而可造成pi3k-akt异常激活,从而可能造成mc的肥大和ecm异常分泌等细胞表型和功能的改变。然而,糖尿病肾病时更为重要的pi3k- akt信号通路的异常改变使pten活性降低,pten活性的降低使pi3k-akt信号通路持续处于激活状态,可能是糖尿病肾病时mc肥大和大量分泌ecm的重要机制,提高pten活性可能是治疗糖尿病肾病的重要靶点。
我们既往的研究发现,中药菟箭合剂可以减少糖尿病大鼠mc的表型转化,减轻肾小球系膜区ecm的堆积[1]。为了进一步研究菟箭合剂的作用机制,我们观察了菟箭合剂对高糖条件培养的mc磷酸化pten和akt的作用。结果表明,高糖条件培养的mc磷酸化pten水平显著降低,而磷酸化akt水平显著升高,菟箭合剂含药血清则可显著升高mc细胞内磷酸化pten水平,同时显著降低磷酸化akt水平。
本实验中我们采用将所有组别大鼠mc培养液中的胎牛血清用大鼠血清替换的方法,药物干预组与对照组之间的差别仅为是否为含药血清和含药血清稀释浓度的差别,从而排除了由于血清种类不同对实验结果的干扰。
【参考文献】
[1] 尹德海,梁晓春,郑法雷,等.糖尿病大鼠肾小球mc表型转化及菟箭合剂的作用[j].中国中西医结合杂志,2003,23(10)：772-776.
[2] mahimainathan l, das f, venkatesan b, et al. mesangial cell hypertrophy by high glucose is mediated by downregulation of the tumor suppressor pten[j]. diabetes, 2006,55(7)：2115-2125.
[3] 堪贻璞,高 进,刑宝才,等.肾小球系膜细胞培养[j].北京医科大学学报,1989,21(4)：335.
[4] 刘志红,陈朝红,李颖健,等.2型糖尿病肾病患者肾小球系膜细胞表型及功能改变[j].中华医学杂志,2001,81(22)：1369-1373.
