作者：黄颖，张丙芳，招明高，王晓明，黄晨
【摘要】 目的： 研究 cbiq对肺泡上皮细胞株a549氧化损伤的保护作用. 方法 ： 应用 mtt法检测不同浓度cbiq对正常及过氧化氢（h2o2）损伤的肺泡上皮细胞株a549的保护作用；dna ladder检测细胞凋亡；相差显微镜观察hoechst染色后细胞凋亡形态的变化. 结果： h2o2损伤后的a549细胞经不同浓度cbiq处理后，细胞死亡数明显减少. 浓度为1×10-2，1×10-3 mmol/l的cbiq组平均细胞存活率分别为(76.1±0.8)%，(71.3±1.0)%，较损伤组(46.3±0.9)%明显增高(p<0.01)；终浓度为100 μmol/l h2o2及10 μmol/l cbiq共同干预a549细胞4 h后，可检测到凋亡标志性的dna梯形带；实验组细胞凋亡率较对照组明显下降(p<0.05). 结论： 在一定浓度范围内，cbiq对氧化损伤的a549细胞生长有浓度依赖性的保护作用，并可抑制氧化损伤的a549细胞发生凋亡.
【关键词】 cbiq；急性病；肺/损伤；肺泡；上皮细胞
【abstract】aim: to explore the protective role of 4chlorobenzo［f］isoquinoline (cbiq) in oxidatively damaged human lung epithelial cell line a549. methods: after cultured with different doses of cbiq, the normal a549 cells and the oxidatively damaged cells were both tested by mtt assay. cell apoptosis was detected by dna ladder. cell morphological change was observed by hoechst staining under a phase contrast microscope. results: after a549 cells were treated with different concentrations of cbiq, dosedependent protection was demonstrated. the cell viability rate of the group by 1×10-2 and 1×10-3 mmol/l cbiq were respectively (76.1±0.8)% and (71.3±1.0)%， which were higher markedly than the rate of the injury group (46.3±0.9)% (p<0.01). four hours after exposure to 100 μmol／l h2o2 and 10 μmol/l cbiq, a549 cells undertook the apoptosis displayed by the dna ladder. the percentage of cell apoptosis was lower in experimental group than in control group (p<0.05). conclusion: in a certain concentration range, cbiq can dosedependently protect human lung epithelial cells from oxidatively damage. the activator of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (cftr) can inhibit the apoptosis of oxidatively damaged a549 cells.
【keywords】 cbiq; acute disease; lung/injuries; pulmonary alveoli; epithelial cells
0引言
急性肺损伤(acute lung injury，ali)是急性呼吸衰竭的重要病因之一. 氧化应激时产生的大量氧自由基和h2o2作用于肺部时可引起肺泡上皮细胞活性降低，甚至产生ali. 肺泡上皮细胞na+，cl-异常跨膜转运在肺水肿形成中起重要作用［1］. 囊性纤维跨膜电导调节因子(cftr)是肺泡上皮细胞中一种氯通道蛋白，cftr异常可降低其对na+通道的抑制作用，致na+重吸收增加，加上cl-分泌减少，易导致肺组织水肿. cbiq是一种cftr氯通道特异性开放剂［2-3］，能促进cftr氯通道开放，使na+向细胞内流动增加，提高肺泡的液体清除能力. 我们采用a549细胞作为肺泡上皮细胞模型，观察cbiq对氧化应激引起a549细胞损伤的保护作用，探讨cftr氯通道及cbiq在ali发生 发展 中的作用.
1材料和方法
1．1材料
人肺泡上皮细胞模型a549细胞由第四军医大学生物化学与分子生物学教研室惠赠. cbiq（sigma公司）；噻唑蓝(mtt)（sigma公司）；dna ladder 试剂盒、荧光染料hoechst 33258（上海碧云天公司）；新生牛血清(杭州四季青) 1640培养液(gibco公司).
1．2方法
1．2．1噻唑蓝(mtt)比色实验测定细胞存活率用含100 ml/l热灭活新生牛血清的1640培养基培养a549细胞，置37 ℃，50 ml/l co2及充分饱和湿度的培养箱内，隔日换培养液，直至细胞铺满瓶底的70%～80%，用胰蛋白酶消化并传代，选对数生长期a549细胞以2×103个/孔接种于2块96孔培养板，细胞贴壁培养24 h后开始干预. 第1块板分2组. 对照组：只加培养液；实验组：分别加入不同浓度的cbiq（浓度分别为1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5 mmol/l）. 反复试验8次. 第2块板分3组：对照组：只加培养液；损伤组：加入100 μmol/l h2o2；实验组：加入100 μmol/l h2o2后再分别加入不同浓度的cbiq（浓度分别为1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5 mmol/l）. 反复试验15次. 干预后共孵育24 h进行mtt实验，每组设5个复孔. 与实验组平行设只加培养液不加细胞的空白对照孔，比色时以此孔调零. 酶联免疫检测仪测定不同药物浓度的a490 nm. 以每组5个孔a490 nm的平均值作为各组的平均a490 nm值. 记录结果，取数次结果的平均值， 计算 各组细胞的存活率：细胞存活率=(实验组a490 nm ／对照组a490 nm)×100％.
1．2．2dna梯形带法检测细胞凋亡实验共分3组. 对照组：正常细胞；损伤组：加入100 μmol/l h2o2；实验组：加入100 μmol/l h2o2后再加入1×10-5 mol/l的cbiq. 细胞经干预后收获约1×106个细胞，pbs洗涤2次，加含2.5 μl蛋白酶k的裂解液500 μl裂解细胞，50℃水浴过夜；采用苯酚氯仿抽提法，4℃高速离心提取dna，加60 μl醋酸胺和600 μl冷无水乙醇-20℃过夜；4℃高速离心10 min， 700 ml/l冷乙醇700 μl漂洗沉淀， te缓冲液60 μl溶解dna. 取5 μl dna溶液进行18 g/l琼脂糖凝胶电泳，将电泳凝胶置于gel doe 2000凝胶图像扫描 分析 系统，扫描图像.
1．2．3hoechst33258荧光染色观察细胞凋亡率实验共分3组. 对照组：正常细胞；损伤组：加入100 μmol/l h2o2；实验组：加入100 μmol/l h2o2后，再加入1×10-5 mol/l cbiq. 细胞干预前于6孔板中铺板爬片，每孔约5×104个细胞. 干预6 h后将玻片取出，40 g/l多聚甲醛固定10 min，pbs洗涤，hoechst染色5 min，置于荧光显微镜下观察细胞形态及细胞核的变化. 对每张细胞片随机选取5个高倍视野，分别计数正常细胞数(胞膜完整，着均匀蓝色)，凋亡细胞数(核染亮蓝色，呈均匀的致密斑块或分叶状)，每个样品至少计数100个细胞，镜下计数细胞凋亡率. 取5次结果的平均值.
统计学处理：实验数据均以x±s表示，采用统计软件spss 12．0进行anova方差分析. p<0.05为差别有统计学意义.
2结果
2．1细胞存活率浓度为1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5 mmol/l cbiq实验组细胞平均存活率分别为(71.6±3.9)%，(98.7±1.8)%，(99.2±1.6)%，(97.6±2.3)%，(97.9±2.4)%. 其中浓度为1×10-1 mmol/l组与对照组（100%）比较差异有统计学意义（p<0.05）. h2o2损伤组细胞存活率为(46.3±0.9)%；浓度为1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5 mmol/l的cbiq实验组平均细胞存活率分别为(63.8±0.9)%，(76.1±0.8)%，(71.3±1.0)%，(63.9±0.9)%，(62.3±1.0)%. 其中浓度为1×10-2，1×10-3 mmol/l组与损伤组比较差异有统计学意义（p<0.01）.
2．2凋亡的检测dna梯形带检测结果显示a549细胞染色质dna裂解成180～200 bp和其不同倍数的片段，琼脂糖凝胶电泳后显示出凋亡细胞特有的梯形带（图1）.
2．3凋亡率的测定h2o2损伤组凋亡率为(47.3±2.7)%，镜下可见细胞凋亡数明显增多，且多为分叶状（图2）. cbiq实验组为(28.5±3.9)%，较损伤组细胞凋亡数明显减少，且多为致密斑块，两组差异有统计学意义（p<0.05）.
3讨论
渗透性肺水肿尤其是肺泡内水肿是导致ali时低氧血症的主要病理基础之一［4］. 肺泡上皮细胞作为ali主要受损的靶细胞，具有保持肺泡相对干燥的屏障功能. 在致伤因素作用下，肺泡上皮细胞损伤，导致液体漏入肺泡腔；肺泡上皮液体转运机能受损，肺泡内液体清除障碍，造成肺泡性肺水肿［5］.
cftr氯通道是肺泡上皮细胞中起最主要作用的一种氯离子通道. su等［6］发现cftr氯通道和质子门控钠通道共同存在于人呼吸道黏膜腺细胞和呼吸道上皮细胞，在损伤肺组织的水盐转运中共同起调节作用. 对鼻腔黏膜上皮细胞及中耳上皮细胞均有类似 研究 ，cftr氯通道可抑制na+重吸收，在鼻炎及中耳炎的液体分泌中有重要意义［7-8］. 但在肺泡上皮细胞水平的研究较少. gu等［9］ 通过在体实验观察到使用cftr开放剂ns004可增加肺泡液体清除率，提示可能与na+转运有关. szkotak等［3］在正常呼吸道上皮细胞中发现cbiq可通过同时开放细胞顶膜的cftr氯通道和基底侧膜的ca2+敏感k+通道从而增加c1-和k+分泌. 理论 上，可进一步通过质子泵的作用使na+重吸收减弱，水排出增加，由此cbiq比ns004更具有优越性.
我们采用多种检测细胞活性及凋亡的 方法 ，从细胞凋亡的角度观察到cbiq对a549细胞氧化损伤的保护作用. 成功模拟了急性肺损伤细胞模型，证明了一定浓度的cbiq可减少细胞的凋亡. 在mtt实验中，随着cbiq浓度增高，细胞凋亡或死亡不同程度的减少. 当剂量达1×10-2 mmol/l和1×10-3 mmol/l时，保护作用更加明显，表明cbiq对细胞的保护作用随浓度增加而增强. 实验中观察到cbiq可抑制氧化损伤所导致的a549细胞系的凋亡. dna ladder法检测到凋亡所具有的典型梯形条带；hoechst染色后，倒置显微镜下可直接观察到凋亡细胞减少. 关于cbiq是通过 影响 何种通路来抑制氧化损伤所导致的a549细胞的凋亡， 目前 尚未见到相关报道，可能与抑制erk相关［10］. 由此可见，cbiq可维持氧化损伤细胞的cftr氯通道功能的正常，这对保持肺泡上皮细胞活性具有重要意义.
【 参考 文献 】
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