作者：王春杨，张金山，张远强，孙圣坤，蔡伟， 高江平，洪宝发，王晓雄 ，王红
【摘要】 目的： 研究 肿瘤抑制基因brca1对胰腺癌的作用和其蛋白在胰腺癌组织中的分布和肿瘤发生中的蛋白特性. 方法 ： 以乳腺癌的细胞株作为阳性对照组，对胰腺癌组织中的brca1亚细胞分布做了免疫荧光双重染色，免疫组织化学等实验并进行量化. 结果： brca1蛋白在胰腺癌的组织中呈一定比例分布，这点在不同的胰腺癌患者组织标本中得到证实. 免疫荧光双重染色法证实brca1蛋白在胰腺癌细胞胞质和胞核间互动，这是国内首次发现和报道brca1在胰腺癌组织细胞中胞质和胞核间互动现象和其亚细胞分布情况. 结论： 我们的多病例研究结果都证实brca1的胞质胞核有比例明确分布，提示可能是参与胰腺癌组织中蛋白功能调节机制，并可能具有与胰腺癌发生相关的蛋白特性，在胰腺癌细胞其亚细胞分布现象预示着将有更好的胰腺癌临床 治疗 的生物靶点.
【关键词】 胰腺肿瘤；brca1；组织；出核
【abstract】aim： to investigate brca1 distribution in pancreatic cancer tissue and its protein characters in the development of cancer. methods： using the human breast cancer cell line mcf7 as positive control, the subcellular distribution of brca1 was investigated in pancreatic cancer tissue by double immunofluorescence staining and immunohistochemistry. results： brca1 was distributed in different pancreatic cancer tissues. double immunofluorescence staining revealed that the interaction of brca1 protein between cell plasm and nucleus stimulated brca1 nuclear export was obvious in different pancreatic tissues. brca1 nuclearcytoplasmic shuttling manner was correlated with cancer development. conclusion: distribution of brca1 in plasm and nucleus of pancreatic cancer cells indicates that it may be involved in protein function regulation of pacreatic cancer tissue, possess the characters of proteins related to cancer development, and become a better biological target for the clincal therapy of pancreatic cancer.
【keywords】 pancreatic neoplasms; brca1; tissues; nuclear export
0引言
近年来研究表明，brca1的背景是乳腺癌相关蛋白，其基因是肿瘤抑制基因之一. brca1蛋白由1863个氨基酸组成，有n端、c端和中间atm, atr的磷酸化区组成. 如果有brca1基因突变的患者直到70岁前其乳腺癌的发病率85%左右，这比普通人群远远高出20倍. 许多高度散发型乳腺癌和卵巢癌的病例也有brca1蛋白表达明显降低的现象，许多研究已经提示了其在散发型乳腺癌和卵巢癌中的重要作用［1］ ；但brca1在胰腺癌组织的分布及其作用近年鲜有报道. 很多证据证实brca1 在许多细胞过程中是非常必须的：如dna 修复, 细胞周期，checkpoint control, 转录调节和凋亡，直到染色体重建［2-5］, 但是其肿瘤抑制功能中的作用机制有待进一步研究，尤其是在胰腺肿瘤等与激素有关的肿瘤中brca1特性蛋白和导致肿瘤发生的原因需要进一步研究，我们对brca1蛋白在胰腺癌的分布和特性以及可能有关机制进行了研究和讨论.
1材料和方法
1.1材料
解放军总 医院 确诊胰腺癌病例石蜡包埋标本20例，第四军医大学组胚教研室胰腺癌病例石蜡包埋存档标本15例. 荧光显微镜（olympus bx60），小鼠抗人brca1 mab（molecular probes）, fitc标记的和avidintexas red 标记的第2抗体（山羊抗小鼠igg，molecular probe公司）和苏木精和伊红（he）染料.
1.2方法
1.2.1组织切片制备胰腺癌组织切成4 mm×5 mm的方块，经40 g/l多聚甲醛固定(含苦味酸)后梯度脱水、浸蜡过夜高温包埋. 石蜡切片机进行切片，成5 μm石蜡切片，经贴片、脱蜡、复水等过程后准备做抗体染色或he染色.
1.2.2免疫荧光双重染色和免疫荧光显微镜观察细胞阳性对照操作：消毒无菌的盖玻片无菌操作在洁净台下用镊子放在6孔板中，2.5 g/l的胰酶消化后的mcf7用dmem培养液悬浮后分装到6孔板中，每孔细胞数量2×105，细胞贴壁后24 h置入-20℃, 700 ml/l乙醇中固定10 min，ph值7.2~7.4的0.01 mol/l pbs冲洗充分后与准备好的组织切片成套以20 ml/l bsa封闭1 h，浸润brca1第一抗体（稀释比例1∶100，molecular probes）4℃过夜. 第二抗体fitc羊抗小鼠（稀释比例1∶400，molecular probes）或者第二抗体avidintexas red 山羊抗小鼠（稀释比例1∶400，molecular probes）室温摇动充分浸润4 h. ph值7.2~7.4的0.01 mol/l pbs冲洗3遍，最后以dapi复染10 min，荧光封片剂封片（vector）待观察计数。wWW.11665.Com每组实验重复进行3次. 显微镜观察时每个病例取5组切片，每张切片读取10个高倍视野约500个肿瘤细胞.
1.2.3he染色选择相邻组织切片经贴片、脱蜡、复水的胰腺癌病例组织切片后，再经苏木精染色10 min，常规梯度脱水，800 ml/l乙醇脱水后经伊红染色1 min，依次经900, 1000 ml/l乙醇脱水、二甲苯透明，封片剂封片待观察以确定显微镜下肿瘤组织和细胞.
统计学处理: 所有数据均采用x±s表示， 组间比较采用t检验，p<0.05 为差异有统计学意义.
2结果
2.1brca1蛋白在人胰腺癌组织的表达免疫荧光染色实验和荧光显微镜的形态学观察结果证实胰腺癌存在brca1蛋白表达，作为阳性对照的人类乳腺癌系细胞株有85%以上的细胞表达brca1，35例胰腺癌组织有40%的细胞表达brca1，且其中有25%蛋白在细胞核分布, 40%胞核、胞质同时存在，35%只在胞质中存在brca1蛋白（图1~3）. 免疫荧光显微镜观察到细胞表达brca1以中等强度的avidintexas red或fitc荧光信号为标准.
2.2brca1蛋白在不同胰腺癌患者标本的分布brca1蛋白出核现象在一些病例非常明确，brca1的组织分布有核质比例改变，甚至brca1蛋白在细胞核没有分布，仅在细胞质可以观察到brca1的分布，这样的病例有14个包埋标本，比例是40%左右. 对于大多数胰腺癌患者的组织切片brca1蛋白在细胞核和质的细胞分布比例是均匀的，这部分病例组织中brca1蛋白分布在细胞质和细胞核占45%~53%，brca1蛋白在细胞质的细胞分布比例由31%到47%（图1~3）.
3讨论
brca1是肿瘤抑制基因之一，brca1是乳腺癌、卵巢癌相关蛋白，在前列腺癌和结肠肿瘤等众多肿瘤中存在；由1863个氨基酸组成，有n端、c端和中间atm, atr的磷酸化区组成. 在对dna 损伤的细胞性反应中有许多重要关键作用. 近年来有关文章报道brca1在乳腺肿瘤细胞的分布很明确［6-7］，并在dna 修复，细胞周期，转录调节和细胞凋亡等功能中有相应的重要作用，但是关于brca1在胰腺肿瘤的分布和相关功能报道很少，本 研究 的创新性就在于首次以免疫组织化学和免疫荧光双重标记等 方法 证实了brca1蛋白在胰腺癌细胞存在，提出了brca1与乳腺癌，卵巢癌、结肠癌以外还与另一种激素相关的腺体肿瘤胰腺癌相关.
brca1 蛋白功能的许多方面都需要其有细胞核分布 ，例如dna 修复、转录调节和细胞周期checkpoint 控制。 最近的研究表明 brca1蛋白是一种细胞核、细胞质的互动蛋白 ［8］. 尤其是在乳腺肿瘤细胞、卵巢肿瘤细胞中照射后其出核现象和功能的讨论有很多相关报道［9-10］. 但是关于其真正的出核机制研究却不是特别清楚. 本研究还通过免疫荧光双重染色法结果明确表明胰腺癌的brca1蛋白表达也有细胞核、细胞浆的互动现象，并且和以往关于其他肿瘤的研究不同，brca1蛋白表达在细胞质和核同时存在的比例非常高. 我们的研究证实brca1蛋白在胰腺癌细胞胞质和胞核间互动现象，这是国内首次发现和报道brca1在胰腺癌组织细胞中胞质和胞核间互动现象和其亚细胞分布情况.
本研究重点发现了胰腺癌组织的brca1蛋白表达，而且与brca1在乳腺和卵巢癌细胞株也是胞质胞核互动性蛋白的观点也一致，但发生brca1蛋白的核质比例改变在胰腺癌组织很特殊，并且与肿瘤发生 发展 机制和功能可能有密切关系. 在胰腺癌细胞其亚细胞分布现象提出了 科学 研究下一步 问题 ，而明确在胰腺癌组织细胞brca1蛋白的出核现象，有助于将来对他们进一步检测和判定其与胰腺癌的恶性程度和进程相关性，也可能为将来引用新的生物 治疗 胰腺癌办法提供新的思路.
综上所述，我们得出以下结论：①胰腺癌组织细胞中明确存在brca1蛋白表达，其正常分布比例为细胞核占25%，细胞核与质占40%；细胞质占35%。提示可能是参与胰腺癌组织中蛋白功能调节机制; ②其质核分布比例在不同的病例各有特点, 即brca1在胰腺癌组织有蛋白出核现象，从而核质比例改变，进一步提示brca1可能具有与胰腺癌的发生相关的蛋白特性; ③brca1出核现象可能与dna修复功能以及与肿瘤恶性程度相关，也提示是好的临床治疗靶点.
【 参考 文献 】
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