【摘要】 目的： 探讨血清hbeag和肝癌组织中p53突变的关系及其在肝癌发生中的作用. 方法 ： 应用 elisa法检测血清hbeag，pcr结合直接测序检测p53突变. 同时 分析 相关临床病理因素. 结果： 在42例患者中hbeag阳性者20例，占47.6%; p53突变25例，占59.5%; hbeag阳性同时伴有p53突变者16例. hbeag的表达情况与肿瘤数目（p=0.002）、分化程度（p=0.025）、复发（p=0.026）有关; p53突变与肿瘤数目（p=0.013）、包膜（p=0.046）、分化程度（p=0.013）、复发（p=0.003）有关; hbeag阳性与p53突变有关（p=0.024）. hbeag阳性及p53突变患者的术后复发时间较短（4.6±2.1）mo（p<0.001）. 结论： hbeag阳性和p53突变在肝癌的发生 发展 中起重要作用，常提示预后较差.
【关键词】 肝炎e抗原,2型；基因,p53；癌,肝细胞；预后
【abstract】 aim: to study the roles of the serum hbeag and the p53 mutation in the development of hepatocellular carcinoma(hcc).methods: elisa was applied to detect serum hbeag and pcr and direct sequencing method were used to detect the p53 mutation. the clinicopathologic characteristics were also analyzed.results: in 42 hcc cases, 20 cases(47.6%) were serum hbeag positive, and 25 cases(59.5%) had p53 mutation.among them, 16 cases were overlapped. hbeag had a significant correlation with tumor count（p=0.002）, degree of the tumor differentiation（p=0.025）and recurrence（p=0.026）. p53 mutation was also significantly correlated with tumor count（p=0.013）, capsule（p=0.046）, degree of the tumor differentiation（p=0.013）and recurrence（p=0.003）.there was a close relationship between serum hbeag positivity and p53 mutation（p=0.024）.the recurrence time was shorter in the patients with positive hbeag and p53 mutation ［(4.56±2.13)months, p<0.001］.conclution: serum hbeag and p53 mutation play important roles in the development of hcc, and they imply a poor prognosis.
【keywords】 hepatitis b e antigens; genes, p53; carcinoma, hepatocellular; prognosis
0引言
根据流行病学调查发现肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, hcc)与乙型肝炎病毒(hepatitis b virus, hbv)感染密切相关. 慢性hbv感染者中hcc发生的高危性比非hbv感染人群高约200倍［1］. 我国hcc主要发生在慢性hbv感染者，hbv感染可从无症状病毒携带发展为急性肝炎、慢性肝炎、重症肝炎、肝硬化、hcc，其临床结局与hbv在体内演变的情况和机体的免疫应答有关［1］，鉴定体内hbv的感染状况对揭示hcc的发病机制有积极意义. 近来发现hbeag与hcc 的复发和预后相关，是一个值得深入 研究 的指标. 为了解hbv hbeag在hcc发生发展中的作用机制，我们检测血清hbeag和hcc中p53突变，并探讨相关的临床病理因素.
1材料和方法
1.1材料
2004/2007 hbsag阳性hcc患者42(男38，女4)例，年龄31~72岁. 挑取手术切除肿瘤组织适量立即置入液氮，其余组织送病理检查. 肿瘤组织均经病理证实. 肿瘤组织放置-80℃冰箱备用. 同时于患者术前1 wk内常规采血3 ml离心后取血清1.5 ml用eppendorf管于-80℃冰箱保存.
1.2方法
取-80℃冰箱保存的癌组织标本约0.03 g，匀浆成细胞悬液，然后按照tianamp genomic dna kit （北京天根公司提供）的说明书提取dna. 样品储存于-20℃. hbeag检测采用elisa方法，由厦门新创公司提供试剂盒，按说明书操作及判断结果. 设计引物检测p53基因第7外显子249位点. 上游引物为：5′tccta ggttg gctct gac3′，下游引物为：5′caagt ggctc ctgac ctg3′，全长131 bp. 由上海生工协助合成. 按照master mix(北京天根公司提供)说明书行pcr反应. 反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 45 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s, 35个循环；72℃ 5 min. 产物送上海生工协助完成纯化和测序，测序引物同pcr引物.
统计学处理：用spss 13.0统计软件包进行处理. 对计量资料用t检验，对计数资料用χ2检验（或确切概率法）分析，用logrank检验进行复发时间分析.
2结果
2.1hbeag与p53基因的表达情况hbeag阳性者20例（47.6%）; p53突变25例（59.5%，图1：g>t突变）；hbeag阳性同时伴有p53突变者16例. hbeag的表达与肿瘤数目（p=0.002）、分化程度（p=0.025）、复发（p=0.026）有关；p53突变与肿瘤数目（p=0.013）、包膜（完整/不完整或无）（p=0.046）、分化程度（p=0.013）、复发（p=0.003）亦有关（表1~2）. 经统计 分析 ，hbeag阳性16例，阴性9例，p53突变阳性16例，阴性4例，hbeag表达与p53突变有关（p<0.05）. 表1hbeag表达与临床病理因素分析（略）表2p53表达与临床病理因素分析（略）
2.2复发时间分析截止至200708，随访发现复发者24例，其中hbeag阳性者15，阴性者9例，p53突变者19例，野生型者5例，hbeag阳性及p53突变者15例. 统计发现，hbeag阳性及p53突变者复发时间（4.6±2.1) mo，短于hbeag阴性及p53野生者（9.3±3.4）mo，差异有统计学意义（p＜0.001）.
3讨论
慢性hbv和hcv感染是慢性肝炎 发展 为肝硬化直至最终发展为hcc的最重要因素［1］. 近来 研究 发现，hbeag是hcc复发的独立风险因素和预后不良指标［2-3］. hbeag是hbv基因组前c/c区段的mrna表达，与hbvdna关系密切，hbeag阳性者病毒复制活跃，传染性强［4］. p53是细胞生长周期中负调节因子，与细胞周期的调控、dna修复、细胞分化、细胞凋亡等重要的生物学功能有关［5］. p53的突变在肿瘤发生中起重要作用，是hcc发生的重要基因因素. 我们发现，hcc患者中，有47.6%的hbeag阳性，说明在hcc中活动性肝炎占有相当大的比例. 而长期的活动性肝炎的存在可能伴有活跃的肝细胞损伤/修复，同时各种炎症因子的大量存在， 影响 各种信号的传导甚至造成基因的突变，从而使hcc发生的机会增加［6］. 本组病例中，共有25例发生p53突变，占59.5%（25/42）. 经统计分析发现，p53的突变与hbeag阳性相关. 提示在乙肝相关性hcc中，hbeag的持续阳性可能是造成p53突变，进而促使hcc发生的原因. 孙惠川等［7］发现，hbeag阳性是术后复发的高危因素. hbeag与肿瘤数目、分化程度、复发等临床病理因素有关.
hbeag阳性的hcc患者术后复发率较高（75.0%，15/20），提示hbeag阳性预后较差，与孙惠川等［7］的报道相符. 同时发现，p53突变患者与肿瘤数目、包膜（完整/不完整或无）、分化程度、复发等因素有关，术后复发也较高. 李海民等［8］ 应用 免疫组化 方法 ，在78例hcc中有43例p53基因染色阳性，而且表明p53基因的表达与肿瘤的病 理学 分级、临床分期、有无肝内或门静脉转移、是否乙型肝炎有关. 提示p53基因的高表达与肝细胞肝癌预后差有关. 统计发现，hbeag阳性和p53突变同时存在时，术后中位复发时间短于hbeag阴性及p53野生者，患者预后较差. 提示hbeag对hcc发生发展的影响可能通过p53基因的功能异常表达来实现.
【 参考 文献 】
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［3］sun hc, zhang w, qin lx, et al. positive serum hepatitis b e antigen is associated with higher risk of early recurrence and poorer survival in patients after curative resection of hepatitis brelated hepatocellular carcinoma ［j］. j hepatol, 2007, 47(5):684-690.
［4］姜燕, 姜宏, 黄圆圆.乙肝病毒感染者血清hbeag模式与hbvdna定量关系研究［j］.临床肝胆病杂志, 2005, 21(5): 281-28.
［5］朱明华.肿瘤抑制基因p53的生物学功能研究进展和意义［j］.中华病理学杂志, 2000, 29（1）:60-62.
［6］yang hi, lu sn, liaw yf, et al. hepatitis b e antigen and the risk of hepatocellular carcinoma ［j］. n engl j med, 2002, 347(3)∶168-174.
［7］孙惠川, 张伟, 钦伦秀, 等.血清hbeag状态对肝细胞癌患者术后生存的影响［j］.
