血红素加氧酶1在铝过负荷致神经元退行性变中的作用的论文_西医学论文

作者：袁野，郭建增，杨俊卿，周岐新

【摘要】 目的：探讨血红素加氧酶1(ho1) 在铝过负荷致神经元退行性变中变化和意义. 方法：雄性nih小鼠75只，体质量24～26 g，随机分为对照组，氯化铝低剂量组（3.75 mg/d）和高剂量组（7.50 mg/d），每组25只. 各组分别采取脑室内注射人工脑脊液、1.25 g/l氯化铝溶液或2.50 g/l氯化铝溶液3 μl/只，1次/d，连续5 d，建立神经元退行性变模型；以血红素加氧酶(ho)活性和ho1蛋白表达与丙二醛水平，金属离子含量及海马病理形态学变化关系评价ho1在铝过负荷致神经元退行性变中的作用. 结果：与对照组相比，各氯化铝组均可见海马ca1区细胞层变薄伴明显核固缩. ho1蛋白：氯化铝低剂量组0.24±0.01，高剂量组 0.33±0.01; 铁离子含量：低剂量组(31.34±2.85) mg/g，高剂量组(54.01±2.31) mg/g，均较对照组ho1蛋白 0.10±0.01，铁离子含量(22.54±4.48) mg/g显著升高，差异具有统计学意义(p<0.05). 氯化铝高、低剂量组ho活性，丙二醛和铝粒子含量亦均较对照组显著升高，差异具有统计学意义（p<0.05）. 结论：ho1表达上调导致血红素来源铁升高与铝过负荷致神经元退行性变的发生有关.

【关键词】 血红素加氧酶1；铝过负荷；神经元退行性变;铝/毒性

　　【abstract】 aim: to investigate the effect of heme oxygenase1 (ho1) on neurodegeneration induced by aluminum overloading (ao). methods: seventyfive male nih mice weighing 24-26 g were divided into control, aluminum chloride low dosage group (3.75 mg/d, ld) and high dosage group (7.50 mg/d, hd), which were intracerebraventricularly injected with 3 μl per mouse of artificial cerebrospinal fluid, 1.25 g/l aluminum chloride solution and 2.50 g/l aluminum chloride solution, respectively once a day for 5 d to build the neurodegenerative model. the effect of ho1 on neurodegeneration induced by ao was evaluated by parameters including ho activity, ho1 expression, content of malonaldehyde (mda), levels of metal ions, and pathomorphological changes of hippocampi. results: the layer of ca1 pyramidal cells in both ao groups became thinner with pyknotic nuclei than control. the significant increases of ho1 expression (ld 0.24±0.01, hd 0.33±0.01) and level of iron ［(ld (31.34±2.85) mg/g, hd (54.01±2.31) mg/g)］ with elevation of mda level, ho activity and aluminum level were observed in both ao groups, compared with control group ［ho1 0.10±0.01, iron (22.54±4.48) mg/g, p<0.05］. conclusion: neurodegeneration induced by ao may involve in the upregulation of ho1, which raises the level of iron from degradation of the heme.

　　【keywords】 heme oxygenase1; aluminum overloading; neurodegeneration; aluminum/to

　　0 引言

　　铝过负荷是引起神经元退行性变疾病的重要原因之一［1］，其发病机制迄今尚未完全阐明. 有研究发现铝过负荷致神经元退行性变中铁异常升高，且与神经元损伤程度相关［2］. ke等［3］的研究也提示体内铁异常升高涉及神经元退行性变的发生. 血红素加氧酶1（heme oxygenase1，ho1）催化血红素降解是生成内源性铁的主要来源. 本研究拟采用本室建立的铝过负荷致小鼠神经元退行性变模型，探讨ho1在神经元退行性变中的变化及其与内源性铁的关系，旨在揭示ho1参与神经元退行性变过程的本质.

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 ⅰ级nih雄性小鼠75只，鼠龄55 d，体质量24～26 g（动物证书号：scxk20020001，由重庆医科大学实验动物中心提供）；6磷酸葡萄糖、还原型辅酶ⅱ(nadph),氯化正铁血红素和6磷酸葡萄糖脱氢酶(美国sigma公司)；兔抗鼠ho1和ho2多克隆抗体(美国oncogene公司)；丙二醛测定试剂盒(南京生物建成公司)；氯化铝（alcl.6h2o）分析纯(上海兴塔美兴化工厂).

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物分组动物随机分为对照组、氯化铝低剂量组(3.75 mg/d)和高剂量组(7.50 mg/d)，每组25只动物.

　　1.2.2 模型制作参照文献［4］的方法，制作不锈钢导管(外径0.6 mm，内径0.4 mm)和锥形不锈钢内芯(与外套吻合，下端与外套相平).以40 g/l水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉小鼠，俯卧固定. 剪去前囟周围头皮，刮去骨膜，于中线旁1.3 mm，前囟后0.3 mm钻孔. 导管沿孔垂直插入2 mm，用牙托粉和502速凝胶水固定. 术后7 d，对照组小鼠脑室内注射人工脑脊液3 μl/只，其余两组分别注射相同容积的1.25 g/l或2.50 g/l氯化铝溶液；1次/d，连续5 d. 末次注射30 d后行各项检测.

　　1.2.3 组织病理学检测小鼠以40 g/l水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧固定，经左心室快速滴入肝素化磷酸缓冲液(pbs) 50 ml，然后缓慢滴入40 g/l多聚甲醛(pbs 0.1 mol/l，ph 7.4，4℃) 50 ml；同时剪碎肝脏作为血液和灌注液出口. 分离脑组织，于40 g/l多聚甲醛中固定，常规he染色.

　　1.2.4 血红素加氧酶活性检测参照文献［5］的方法进行. 分离海马，加3倍体积匀浆缓冲液(蔗糖0.01 mol/l，三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐0.01 mol/l，乙二胺四乙酸二钠0.0001 mol/l，ph 7.4），4℃匀浆；4℃超声处理30 s；4℃，18 800 g离心15 min；取上清0.2 ml，加反应混合液0.8 ml（6磷酸葡萄糖2 mmol/l，6磷酸葡萄糖脱氢酶3.33 nkat，氯化正铁血红素20 mmol/l，大鼠肝胞质2 mg，nadph 0.8 mmol/l）. 酶促反应在加入nadph后开始计时，37℃避光反应1 h. 加预冷氯仿1 ml终止反应并抽提生成的胆红素. 7500 r/min离心20 min，分离有机相. 波长464～530 nm比色，氯仿调零(胆红素消光系数40/mmol/l/cm). 考马斯亮蓝蛋白定量.

　　1.2.5 蛋白免疫印迹技术检测ho蛋白表达水平按照100 mg组织1 ml细胞裂解液的比例，匀浆提取总蛋白. 以核酸蛋白定量仪进行蛋白定量. 每孔加入40 mg蛋白进行sdspage电泳，蛋白电泳转移仪将分离后的蛋白条带转至硝酸纤维膜上，封闭液室温封闭2 h；按1∶200分别加入兔抗鼠ho1，ho2抗体，37℃孵育2 h；洗膜；按1∶400加入羊抗兔抗体，37℃孵育2 h；化学发光试剂反应2 min，发光成像仪取像并测定条带灰度值. 以ho1或ho2灰度值与βactin灰度值的比值表示蛋白表达水平，比值越高则蛋白表达越高.

　　1.2.6 金属离子含量测定采用等离子体原子发射光谱分光光度仪进行测定. 分离海马并称重，加入2 ml双蒸水匀浆，按8 ml/g脑质量（湿质量）加入25 g/l四乙基氢氧化铵溶液，80℃消化24 h至溶液澄清，双蒸水定容到10 ml. 所有过程均采用一次性塑料试管. 测定波长：铝309.27 nm，铁238.20 nm.

　　1.2.7 丙二醛含量检测按照试剂盒说明书所示操作方法进行.

　　统计学处理：计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析及lsdt检验，p<0.05为差异有统计学意义.

　　2 结果

　　2.1 海马病理组织学检测对照组he染色，海马ca1区锥体细胞3～4层，排列整齐，胞浆呈淡紫色，细胞核呈蓝黑色，胞核为圆形；氯化铝低剂量组和高剂量组he染色均可见海马ca1区神经元出现核固缩、细胞染色加深、细胞形态改变，细胞排列混乱，细胞层次减少. 其中以氯化铝高剂量组细胞损伤最为严重(图1).

　　2.2 海马ho活性 ho活性为对照组(0.60±0.07)×10-6 kat/kg，氯化铝高剂量组和低剂量组分别为(0.95±0.04)×10-6 kat/kg和(0.81±0.06)×10-6 kat/kg；显示各氯化铝组ho活性均较对照组显著升高（p<0.05）；氯化铝高剂量组ho活性也显著高于低剂量组（p<0.05）.

　　2.3 海马ho蛋白表达 ho1蛋白表达水平为对照组0.10±0.010，氯化铝高剂量组和低剂量组分别为0.33±0.01和0.24±0.01；各氯化铝组ho1蛋白表达均较对照组显著升高（p<0.05）；氯化铝高剂量组ho1表达也显著高于低剂量组（p<0.05）. ho2表达水平为对照组0.31±0.01，氯化铝高剂量组0.31±0.01，氯化铝低剂量组0.32±0.02，差异无统计学意义(p>0.05，图2).

　　2.4 海马金属离子水平铝离子含量为对照组（0.35±0.04） mg/g，氯化铝高剂量组和低剂量组分别为（2.08±0.10） mg/g和（1.34±0.13） mg/g. 各氯化铝组铝离子含量均较对照组显著升高(p<0.05). 铁离子含量为对照组（22.54±4.48） mg/g，氯化铝高剂量组和低剂量组分别为（54.01±2.31） mg/g和（31.34±2.85） mg/g. 各氯化铝组铁离子含量均较对照组显著升高(p<0.05)；氯化铝高剂量组铁离子含量显著高于低剂量组(p<0.05).

　　2.5 海马丙二醛含量丙二醛含量为对照组（0.22±0.07） nmol/mg，氯化铝高剂量组和低剂量组分别为（0.63±0.06） nmol/mg和（0.43±0.05） nmol/mg. 各氯化铝组丙二醛含量均较对照组显著升高（p<0.05）；氯化铝高剂量组丙二醛含量显著高于低剂量组（p<0.05）.

　　a：对照组；b：低剂量组(3.75 mg/d×5 d)；c：高剂量组(7.50 mg/d×5 d).

　　图1 海马病理组织学检测 he ×400（略）

　　1: 高剂量组(7.50 mg/d×5 d)；2: 低剂量组(3.75 mg/d×5 d)；3: 对照组.

　　图2 血红素加氧酶蛋白免疫印迹分析结果（略）

　　3 讨论

　　众所周知，铝神经毒性的重要靶点是海马，可导致神经元结构和功能的损伤. 但铝的神经毒理机制尚未完全阐明. 我们采用脑室内微量注射氯化铝法，已成功诱导小鼠海马神经元退行性变. 表现为学习记忆能力减退，海马神经元出现核固缩，染色加深及细胞丢失等；同时发现脑内氧化应激反应增强和铁离子水平显著升高［3-4］.

　　ho1是脑内重要的抗氧化应激系统成员之一，可被多种因素诱导表达［6］，其表达增强对多种因素所致的急性神经元损伤有明显保护作用［7］；这与其催化血红素降解生成具有强自由基清除作用的胆绿素有关［8］. 但ho1在铝负荷致神经元退行性变中是否仍有类似保护作用尚未见报道.

　　本研究发现，微量氯化铝脑室注射30 d后海马ho1蛋白表达及活性均显著升高，铁离子水平和丙二醛含量也随之明显升高，海马神经元出现核固缩和细胞丢失；上述变化随着氯化铝剂量的增加而更加明显，提示在停止氯化铝脑室内注射后，脑组织内存在慢性氧化应激. ho1表达升高是由于机体对慢性氧化应激作出的保护性反应，目的是催化产生胆绿素，清除自由基. 在ho1表达增加的情况下氧化应激反应仍持续增强并最终出现海马神经元退行性变，可能的原因是，ho1表达升高所催化产生的胆绿素量不足以清除自由基，而对抗后者所致的氧化损伤. 产生这种现象可能与ho1催化血红素产生的铁离子水平同步增加有关. 后者能通过fenton反应促进羟自由基产生. 虽然脑内存在铁结合蛋白，络合铁离子而使之“解毒”，但铝离子可竞争铁结合蛋白，使游离铁离子增加［9］. 据此，我们认为在铝过负荷致神经元退行性变中，ho1表达升高具有双重作用：促进胆绿素和铁离子生成；前者虽可抗氧化应激却被迅速消耗，后者因铝离子存在而不能被有效“解毒”，导致氧化应激反应加重，出现进行性神经元退行性变. 近年一些神经退行性变疾病进程伴ho1表达增强的研究报道支持我们的上述观点［10］.

【参考文献】
　　【参考文献】

　　［1］ goncalves pp, silva vs. does neurotransmission impairment accompany aluminium neurotoxicity ［j］. j inorg biochem, 2007, 101(9): 1291-1338.

　　［2］何百成, 腾永真, 杨俊卿, 等. 铝过负荷致小鼠神经元退变与脑铁代谢失衡的关系［j］.

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