融合基因gmcsfbzlf1重组腺病毒表达载体的构建
【关键词】 疱疹病毒4型，人;粒细胞巨噬细胞集落刺激因子;基因，即早;基因融合;遗传载体
【摘要】 目的 构建粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gmcsf)和eb病毒即刻早期基因(bzlf1)融合基因的重组腺病毒表达载体。方法 采用逆转录聚合酶链反应分别获得gmcsf和bzlf1编码序列的cdna，应用剪接式重叠延伸(soe)技术将两段基因通过多肽接头(gly4ser)3 的dna 序列进行连接，构建融合基因gmcsfbzlf1。将融合基因gmcsfbzlf1定向亚克隆至padtrackcmv质粒，在原核细胞e. coli bj5183中完成穿梭质粒与骨架质粒padeasy1的同源重组，构建融合基因gmcsfbzlf1真核表达载体padgmcsfbzlf1。将真核表达载体padgmcsfbzlf1转染293细胞，获得复制缺陷型重组腺病毒vadgmcsfbzlf1。rtpcr鉴定感染重组腺病毒的293细胞中gmcsfbzlf1基因的表达。结果 gmcsfbzlf1基因插入重组腺病毒表达载体的预期位置，且插入序列完全正确;感染重组腺病毒vadgmcsfbzlf1的293细胞中检测到融合基因gmcsfbzlf1的转录表达。结论 成功地构建了融合基因gmcsfbzlf1重组腺病毒表达载体，为进一步探讨gmcsfbzlf1的功能提供了理论基础和实验依据。wwW.11665.cOm
【关键词】 疱疹病毒4型，人;粒细胞巨噬细胞集落刺激因子;基因，即早;基因融合;遗传载体
construction of recombinant adenovirus expression vector encoding gmcsfbzlf1 fusion gene cui ying, wang yun, liu chengyu, et al (qingdao university medical college, qingdao 266021, china); [abstract] objective to construct human granulocytemacrophage colonystimulating factor (gmcsf) gene and ebv encoding immediate early genes (bzlf1) fused to gmcsfbzlf1 gene and the fusion gene recombinant adenovirus expression vector. methods gmcsf cdna and bzlf1 cdna were acquired by rtpcr. the fusion gene gmcsfbzlf1 was constructed through a polypeptide linker (gly4ser) 3 by using spliced overlap extension (soe). the fusion gene gmcsfbzlf1 was subcloned into padtrackcmv plasmid. the shuttle plasmid and the backbone plasmid padeasy1 were recombinated homologously in e.coli bj5183 cells, then fusion gene eukaryotic expression vector padgmcsfbzlf1 were constructed. padgmcsfbzlf1 vector was transfected into 293 cells to obtain recombinant adenovirus vadgmcsfbzlf1. rtpcr was used to identify the expression of fusion gene gmcsfbzlf1 in 293 cells infected with vadgmcsfbzlf1. results the result of dna sequencing demonstrated that gmcsfbzlf1 gene inserted in the expected site in the recombinant adenovirus expression vector and the insertion sequence was wholly correct. the expression of fusion gene gmcsfbzlf1 could be detected in the 293 cells infected with vadgmcsfbzlf1. conclusion the fusion gene gmcsfbzlf1 recombinant adenovirus expression vector has been constructed successfully, which might furnish the rationale and experimental evidence for further study on the function of gmcsfbzlf1 gene.
[key words] herpesvirus 4, human; granulocytemacrophage colonystimulating factor; genes, immediateearly; gene fusion; genetic vectors
eb病毒(ebv)是嗜b淋巴细胞的疱疹病毒，为致瘤病毒之一。文献报道，该病毒与多种人类恶性肿瘤如burkitt淋巴瘤、鼻咽癌(npc)、霍奇金病、免疫缺陷病人的b淋巴细胞瘤及胃癌等发生有关[14]。hoshikawa等[1]研究表明， ebv基因组存在于几乎所有ebv阳性癌组织的癌细胞中，提示ebv可能是治疗ebv阳性肿瘤的理想靶点。ebv即刻早期基因(bzlf1)是诱导潜伏期病毒活化进入裂解期的关键基因，其编码蛋白为转录激活因子，可激活病毒早期基因和晚期基因使病毒进入裂解期进行复制。ebv大量增殖后经细胞膜释放可导致肿瘤细胞溶解死亡，起到选择性杀伤ebv阳性肿瘤细胞的作用[5]。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gmcsf)主要由t细胞和巨噬细胞产生，是一种具有多种生物学活性的细胞因子，将gmcsf基因转入肿瘤细胞内，可以提高其免疫原性从而诱导有效的抗肿瘤免疫应答[6]。本研究拟将gmcsf编码基因和bzlf1进行融合，进而构建融合基因的重组腺病毒表达载体，深入探讨融合基因表达对ebv阳性肿瘤细胞增殖的影响，从而为基因联合治疗ebv相关肿瘤提供实验基础和理论依据。
1 材料和方法
1.1 主要试剂、质粒和细胞系
限制性核酸内切酶ecorⅴ和bglⅱ，t4 dna连接酶，dl 10 000 dna marker，dl 2 000 dna marker，taq dna聚合酶，均购自宝生物工程(大连)有限公司;dna转染试剂盒lipofectamine 2000 购自invitrogen公司;质粒提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品。dmem培养液、trizol、胎牛血清购自美国gibco公司。反转录酶为promega公司产品。qiaexⅱ纯化试剂盒购自qiagen公司。携带gfp报告基因的腺病毒穿梭质粒padtrackcmv，e1 区和e3 区缺失的复制缺陷5型腺病毒骨架质粒padeasy1，大肠杆菌bj5183和dh10b以及人胚肾293细胞，由中国疾病控制中心性病艾滋病中心病毒免疫室邵一鸣教授惠赠。ebv阳性b958细胞系日本鸟取大学医学部生体情报学教室西连寺刚教授惠赠。
1.2 引物设计
根据gmcsf和bzlf1开放读码框序列，以dnastar软件设计扩增人gmcsf和ebv bzlf1 基因的特异性引物，并在gmcsf上游引物的5′ 端引入bglⅱ酶切位点和保护性碱基ga，下游引物3′ 端删除终止密码tga，引入linker;bzlf1下游引物5′ 端引入ecorⅴ酶切位点和保护性碱基gc，上游引物3′ 端引入linker。linker(gly4ser)3为编码15个氨基酸组成的疏水性多肽的dna 序列，序列为5′ggtggcggtggaagcggcggtggcggaagcggcggtggcggcagc3′。gmcsf引物(上游p1、下游p2)和bzlf1引物(上游p3、下游p4)序列见表1。上述序列中下划线部分为linker，黑体部分为酶切位点。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(page纯化)，扩增产物gmcsf长为470 bp，bzlf1长为785 bp，融合基因长为1 210 bp。
1.3 gmscf和bzlf1基因的扩增
取正常人外周抗凝血，用淋巴细胞分层液分离出单个核细胞。将收集的单个核细胞加入含有植物血凝素的dmem培养液中，37 ℃活化24～48 h后收集活化的单个核细胞。采用trizol一步法分别提取外周血活化的淋巴细胞总rna和ebv阳性b958细胞系总rna，参照逆转录试剂盒要求的标准条件合成cdna用作pcr反应模板。pcr反应体系为25 μl，其中包括10×buffer 2.5 μl， mgcl21.5 mmol/l，dntp 0.2 mmol/l，上下游引物各0.3 mmol/l，taq dna聚合酶 1 u，cdna 2 μl，无菌去离子水补至25 μl。反应条件为：94 ℃预变性5 min;然后94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，扩增35个循环;最后72 ℃延伸10 min。pcr扩增产物于含溴化乙锭(0.5 mg/l)的8 g/l琼脂糖凝胶中电泳30 min，紫外线透射仪下观察电泳结果。切胶回收pcr产物，用qiaexⅱ纯化试剂盒进行pcr产物的纯化。表1 bzlf1和gmcsf引物设计名称序列长度gmcsfp1 p1
1.4 目的基因的ta克隆和测序
分别将gmcsf和bzlf1 pcr的纯化产物与pmd18t载体连接，转化入高效e.coli dh10b感受态细菌中，在含有xgal和iptg的氨卞青霉素lb平板上进行蓝白斑选择。分别将tagmcsf和tabzlf1阳性克隆送北京华大基因研究中心进行dna序列测定，测序结果与genbank中gmcsf和ebv标准株bzlf1编码基因序列进行比对。
1.5 融合基因gmcsfbzlf1的构建
以tagmcsf和tabzlf1质粒为模板进行pcr扩增反应，分别获得带有linker互补序列的gmcsf和bzlf1片段。将gmcsf和bzlf1的pcr产物行琼脂糖凝胶电泳后回收纯化，以其为模板采用重叠延伸pcr法[7]获得融合基因片段gmcsfbzlf1。重叠延伸pcr反应体系容积为50 μl, 包括10×buffer 5 μl， mgcl2 3 mmol/l，dntp 0.4 mmol/l，上下游引物p1、p4分别为0.5 mmol/l，高保真taq dna聚合酶2.5 u，模板2 μl，无菌去离子水补至50 μl。反应条件为：95 ℃预变性2 min;然后95 ℃ 45 s、58 ℃ 45 s、72 ℃2 min，扩增35个循环;最后72 ℃延伸10 min。延伸结束以后，向pcr体系中加入datp 2 mmol/l，taq dna聚合酶 1 u，继续72 ℃延伸30 min。将纯化后的gmcsfbzlf1融合基因片段插入到pmd18t载体进行ta克隆，提取质粒dna进行酶切鉴定和dna序列分析。
1.6 重组腺病毒padgmcsfbzlf1的构建
质粒tagmcsfbzlf1和腺病毒穿梭质粒padcmv分别用ecorⅴ和bglⅱ进行双酶切，连接后转化dh10b高效感受态细菌中，培养后挑取白色单菌落，小量提取质粒dna进行padtrackcmvgmcsfbzlf1重组体的pcr筛选及酶切鉴定。
重组padtrackcmvgmcsfbzlf1质粒用限制性核酸内切酶pmeⅰ酶切线性化，并用碱性磷酸酶将线性化质粒去磷酸化，与1 μl(0.1μg)的padeasy1质粒同时转化感受态e.coli bj5183，将转化的bj5183 感受态菌液涂布于含35 mg/l卡那霉素的lb平板，37 ℃培养16～20 h。挑取较小菌落，在含卡那霉素(35 mg/l)的lb液体培养基中37 ℃振摇培养12～16 h，碱裂解法小量提取质粒dna，用限制性内切酶pacⅰ酶切后电泳进行鉴定，阳性质粒命名为padgmcsfbzlf1。构建好的重组腺病毒载体经过测序鉴定，证明插入的序列正确无误。
1.7 重组腺病毒的制备
在25 cm2培养瓶中常规培养293细胞，当细胞生长至50%～70%融合时弃去培养基，按照脂质体转染试剂盒(lipofectamine 2000)使用说明书，将带有gmcsfbzlf1融合基因的重组腺病毒载体转染293细胞。在观察到细胞荧光出现5～7 d后收获细胞，反复冻融3次裂解细胞，离心除去细胞碎片，取上清再次接种293细胞，如此重复3～4 次。
1.8 rtpcr检测gmcsfbzlf1 mrna
用重组腺病毒vadgmcsfbzlf1感染293细胞，3 d后收集细胞，1 000 r/min 离心10 min，弃上清。采用trizol一步法提取细胞总rna，所获rna加dnaseⅰ消化处理可能污染的dna后进行rtpcr检测。作为对照，提取未感染重组腺病毒的293细胞rna进行rtpcr，pcr产物于琼脂糖凝胶电泳检测鉴定。
2 结 果
2.1 目的基因的rtpcr扩增
结果显示，人外周血淋巴细胞gmcsf和ebv阳性b958细胞bzlf1编码序列cdna的pcr产物长度分别为470 bp和785 bp(图1)。序列分析示，gmcsf和bzlf1编码序列cdna与genbank中标准株相应序列一致。
2.2 融合基因pcr电泳和测序结果
融合基因gmcsfbzlf1的pcr扩增产物长度为1 210 bp。琼脂糖凝胶电泳显示，与dna标准分子质量参照物dl 15 000比较，与预测结果一致(图2)，测序结果与gmcsf、bzlf1以及linker的核苷酸序列一致。
m：dl 2 000相对分子质量标准;①、②gmcsf基因pcr 产物(470 bp);③、④bzlf1 基因pcr 产物(785 bp);⑤阴性对照。
图1 目的基因的pcr扩增产物
m：dl 15000相对分子质量标准;①～⑥gmcsfbzlf1基因pcr产物;⑦阴性对照。
图2 融合基因gmcsfbzlf1的pcr扩增产物
2.3 腺病毒质粒穿梭载体padtrackcmvgmcsfbzlf1的鉴定
质粒tagmcsfbzlf1经bgl ⅱ和ecor ⅴ双酶切后定向亚克隆入穿梭载体padtrackcmv，构建重组质粒padtrackcmvgmcsfbzlf1，提取质粒padtrackcmvgmcsfbzlf1行限制性核酸内切酶bgl ⅱ和ecor ⅴ双酶切分析，得到长1 210 bp的融合基因片段和约9 200 bp的片段(图3)。
2.4 融合基因gmcsfbzlf1真核表达载体的构建和鉴定
padtrackcmvgmcsfbzlf1与padeasy1质粒共转化感受态e. coli bj5183发生同源重组获得padgmcsfbzlf1重组体，对padgmcsfbzlf1重组体测序分析表明，padgmcsfbzlf1真核表达载体构建成功，融合基因gmcsfbzlf1片段插入正确。重组腺病毒载体携带2个独立的cmv启动子表达盒，分别表达融合基因gmcsfbzlf1和gfp;转染48 h后即在荧光显微镜下观察到293细胞中gfp荧光，可间接反映融合基因的表达。随传代次数增加，重组腺病毒感染性稳定且增强，致细胞病变作用的时间缩短，通常传至4～5代时，在接种病毒后24～48 h，可观察到几乎所有细胞均出现荧光，此时收获病毒，重组病毒命名为vadgmcsfbzlf1。提取重组腺病毒感染293细胞总rna经rtpcr扩增，琼脂糖凝胶电泳显示特异性1 210 bp预计大小的片段(图4)，表明重组腺病毒在293细胞能有效转录。
3 讨 论
ebv相关肿瘤组织中ebv只存在于癌细胞而正常细胞阴性，使靶向基因治疗ebv相关肿瘤有可能通过ebv而实现。由于在ebv阳性的肿瘤细胞中，病毒通常以潜伏形式存在，并不影响宿主细胞的正常代谢，因此诱导其进入裂解期，进而特异性杀伤ebv阳性肿瘤细胞，有望成为治疗ebv相关肿瘤新的手段。
近年来许多研究结果表明，bzlf1表达可诱导病毒潜伏期活化进入裂解期，bzlf1编码蛋白为转录激活因子，可诱导潜伏状态的ebv进入裂解期复制[8]。孙淑红等[5]研究显示，携带外源性bzlf1基因的重组腺病毒能有效感染ebv阳性上皮细胞，进而诱导细胞潜伏期ebv进入裂解期进行复制，ebv增殖后经细胞膜释放最终可以特异性地杀伤ebv阳性肿瘤细胞。
细胞因子基因免疫是目前肿瘤基因治疗研究的热点，将具有抗肿瘤作用的细胞因子基因导入宿主体内，并使之稳定有效地表达，使体内持续存在一定水平的内源性细胞因子以发挥抗肿瘤的作用。gmcsf是一种重要的免疫调节分子，它不仅可诱导在t细胞免疫反应中起关键作用的dc细胞成熟、分化，而且在免疫治疗过程中可增强主要和次要的抗体反应，以促进dc等apc分化、成熟和活化及上调cd86的表达水平，增强中性粒细胞、单核巨噬细胞、嗜酸性粒细胞对肿瘤细胞的吞噬作用和adcc效应等活性;促进th、tc、nk细胞在肿瘤部位浸润，抑制肿瘤细胞的生长。gmcsf强烈激活特异免疫反应这一突出作用可用于肿瘤治疗。nakamura等[9]用腺病毒将表达于ct26细胞中的鼠内源性肿瘤抗原基因gp70和gmcsf转导入小鼠骨髓dcs, 由于gmcsf转入表达肿瘤相关抗原的dcs细胞，能够提高dcs细胞趋化因子cc亚族受体7的表达，而增强dc细胞迁移进入引流淋巴结的能力，从而诱导有效的抗肿瘤免疫应答。qiu等[10]通过重组腺病毒将p53和gmcsf基因共转导入人喉癌hep2细胞，发现可以有效诱导肿瘤细胞的凋亡，促进肿瘤特异性tc细胞大量浸润并抑制hep2细胞的增长。
已经有研究证实，将细胞因子基因gmcsf转入肿瘤细胞可使肿瘤细胞的免疫原性增强而致瘤性下降，从而提高诱导机体特异性的抗肿瘤免疫反应，但是该作用不够强大，对已发生的肿瘤治疗效果较差。为此，我们综合肿瘤基因治疗和细胞因子基因治疗的作用特点，将bzlf1基因和gmcsf基因融合后构建重组腺病毒表达载体，同时发挥bzlf1基因靶向杀伤ebv阳性癌细胞和gmcsf基因增强机体的抗肿瘤免疫作用。该融合基因载体可以在基因水平上对bzlf1和gmscf基因拷贝数进行控制，精确控制两种功能性蛋白的比例，以达到最佳治疗效果，从而为探讨融合基因协同杀伤ebv阳性肿瘤细胞的作用奠定实验基础。
本研究将gmscf和bzlf1基因进行融合，成功构建了重组腺病毒表达载体。基因融合采用经典的重叠延伸pcr法，使用柔性连接子(linker)将gmcsf和bzlf1基因相连，简化了基因融合过程。而表达载体则采用当今广泛应用的adeasy系统，该系统可在原核细胞e. coli bj5183中完成穿梭质粒与骨架质粒之间的高效同源重组，经抗生素培养板筛选重组体，然后转染293细胞获得重组病毒，使得载体的构建程序快速而有效。
重组腺病毒表达载体经293细胞包装获得重组腺病毒vadgmcsfbzlf1，rtpcr鉴定结果表明vadgmcsfbzlf1重组腺病毒可在293细胞中有效转录。为进一步探讨该融合基因在ebv阳性肿瘤细胞的表达，同时发挥gmscf基因增强抗肿瘤免疫和bzlf1基因诱导潜伏期ebv进入裂解期复制的作用，进而协同杀伤ebv阳性肿瘤细胞奠定了实验基础。
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