【摘要】 目的 人食管鳞癌细胞株eca109中fas相关死亡结构域蛋白(fas associated death domain protein, fadd)表达与 紫杉醇的关系影响分析,紫杉醇在食管鳞癌治疗中的作用机制探讨。方法 流式细胞术检测不同浓度紫杉醇处理下，人食管癌细胞株eca109细胞凋亡率，同时采用western blotting分析细胞中fadd的表达变化。结果 紫杉醇诱导人食管癌细胞株eca109细胞凋亡呈剂量依赖性;随着紫杉醇剂量的增加，实验组eca109细胞中fadd表达呈显著增高。结论 一定剂量的紫杉醇可以提高fadd在食管癌细胞中的表达、促进食管癌细胞的凋亡，这可能是紫杉醇治疗食管癌的分子机制之一。
【关键词】 紫杉醇;食管癌;凋亡;fadd
食管癌是常见消化道恶性肿瘤之一，其发病隐匿,确诊时大多已属于中晚期，使很多患者在手术前后需要接受化学治疗,以确保手术效果，同时化疗也为很多失去手术机会的患者提供了治疗的机会。紫杉醇品名为taxol，最早是wall和wani于1963 年从太平洋红豆杉的皮中提取得到［1］，经过临床试验后近年来已经广泛应用于临床包括食管癌在内的多种肿
瘤的化疗中。紫杉醇可作用于细胞凋亡受体途径的fas/fasl 通路或激活凋亡启动途径的半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶系统(caspases), 诱导细胞凋亡［2,3］，而fadd是fas/fasl凋亡系统中的必需分子，不仅参与细胞凋亡过程的发生，还与细胞周期的调节有关。wWW.11665.coM研究［4］证实从食管正常黏膜到不典型增生的组织中，fadd蛋白及mrna表达呈现显著下降趋势。已有临床研究［5,6］表明紫杉醇联合顺铂、奈达铂、氟尿嘧啶等药物治疗食管癌,可以提高其总有效率,且毒副作用无明显增加，患者耐受性较好，表明紫杉醇在食管癌治疗中具有很高的临床应用价值。同时紫杉醇对人食管癌细胞的生长有明显的抑制作用, 使细胞分裂阻滞于g2-m 期, 并诱导肿瘤细胞凋亡［7］。但现有研究并没有对这一过程中食管癌细胞中fadd的表达变化情况作进一步研究。
作者通过检测不同浓度紫杉醇诱导人食管鳞癌细胞株ec-109 细胞凋亡,并检测细胞表达fadd蛋白的变化情况，探讨紫杉醇抑制人食管癌细胞增殖、诱导细胞凋亡的分子机制,为临床应用提供实验依据。
1 材料和方法
1．1 试剂与药物 泰素(紫杉醇的商品名, 由百时美施贵宝公司惠供, 6 g/l, 分子质量8539 u)，rpmi1640培养液、005%的胰蛋白酶及小牛血清为hyclone产品, annexin v（fitc）/pi凋亡检测试剂盒购于杭州隆基生物工程研究所, 蛋白提取液购于pierce公司，兔抗人fadd单克隆抗体及鼠抗人β-actin单克隆抗体购于santa cruz公司，考马斯亮蓝试剂盒购于南京建成生物科技有限公司。
1．2 细胞与细胞培养 人食管癌细胞株eca-109（atcc）由上海麦莎生物科技有限公司代购。细胞接种于含10% 小牛血清的rpmi 1640培养液培养, 生长于37℃含5% 的co2孵箱中, 待细胞生长至对数生长期开始实验。胰蛋白酶消化细胞后培养基重悬，调整细胞数为5×10.5/ml接种于6孔培养板进行培养， 24 h后更换新鲜培养液，同时实验组培养液中分别加入终浓度为 5、10、20、50 nmol/l 泰素，对照组不加药物，每个浓度设3个复孔，培养24 h后收集各组细胞。
1．3 凋亡检测
收集每组细胞后pbs洗涤离心，细胞重悬于300 μl banding buffer中，加入5 μl annexinv-fitc混匀，室温避光孵育15 min，再加入5 μl pi，室温避光孵育5 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡率，同时以不加annexinv-fitc及pi的一管作为对照。
14 western blotting 分别收集每组细胞，pbs洗涤离心后，加入含蛋白酶抑制剂的蛋白提取液，提取细胞总蛋白并调整蛋白浓度后100℃煮沸变性。取适量蛋白进行sds-page电泳，半干法转膜，封闭，按1：1000分别孵育兔抗人fadd单克隆抗体及鼠抗人β-actin单克隆抗体，4℃过夜后洗膜，按1：1000分别孵育羊抗兔及羊抗鼠二抗，洗膜，化学发光底物显影照相后进行图片分析及数据采集。
1．5 统计学方法
以上实验均重复3次，实验数据采用spss 130软件分析处理，统计学方法采用t检验，组间比较采用单因素方差分析，p<005表示差异有统计学意义。
2 结果
21 紫杉醇诱导人食管癌细胞株eca-109凋亡检测 实验结果显示，实验组细胞凋亡率显著高于对照组，实验组中紫杉醇药物浓度5 nmol/l组与10 nmol/l之间差异无统计学意义，药物浓度升高至20 nmol/l和50 nmol/l后细胞凋亡率显著升高，与5 nmol/l组和10 nmol/l之间差异有统计学意义，见图1。
22 细胞表达fadd 蛋白水平检测 检测结果显示，所有实验组中eca-109细胞表达fadd蛋白水平较对照组均有升高，见图2，a。但仅紫杉醇药物浓度为20 nmol/l组和50 nmol/l组中细胞表达
fadd蛋白水平与对照组差异有统计学意义，见图2,b。
3 讨论
研究结果显示，紫杉醇能诱导人食管癌细胞株eca-109细胞凋亡，当紫杉醇浓度达到20 nmol/l和50 nmol/l时，细胞凋亡率显著升高。这一研究结果提示，只有紫杉醇达到一定血药浓度后，才会对食管癌细胞产生抗癌作用。低浓度紫杉醇作用可能只会抑制细胞增殖，并不一定能引起食管癌细胞的凋亡。fadd是fas受体和部分tnf死亡受体家族成员介导信号通路中的胞质死亡信号衔接蛋白，其羧基端的死亡结构域dd与fas分子胞浆段内的dd结合，当fas与fasl结合导致fas胞内的死亡域形成三聚体而活化,并引起与之结合的fadd构象改变,使caspase- 8前体集聚、断裂和激活,产生有活性的caspase - 8,从而激发一系列下游的caspase - 3 等级联反应, 诱发细胞凋亡［8］。检测结果显示，当紫杉醇诱导人食管癌细胞株eca-109细胞凋亡时，细胞表达fadd蛋白水平显著升高，而低浓度组之间差异无统计学意义。这表明紫杉醇可能通过fas/fasl途径在食管癌治疗中起作用，一定剂量的紫杉醇可以诱导食管癌细胞fadd表达水平的升高，促进癌细胞凋亡。这也提示在抗肿瘤治疗过程中，紫杉醇的用量也是关键。
食管癌的治疗是一个综合治疗的过程，化疗只是所有治疗方法中的一种。紫杉醇虽然在食管癌临床治疗中已经显现出一定的价值，但仍无法彻底改变食管癌疾病的预后。作者也仅仅选用了食管癌中的鳞癌细胞株作研究，还不能代表食管癌所有病理类型，将进一步深入研究，以期能为食管癌的治疗提供更为有价值的理论基础。
参 考 文 献
［1］ wani m c, taylor h l, wall m e,et al. am. chem. soc, 1971, 93:2325-2327.
［2］ ferreira cg, tolis c,span sw,et al. the fas/fasl(cd 95/a po 1)signaling pathway does not mediate drug-induced apoptosis in lung cancer cells.clin cancer res, 2000,6(1):203-212.
［3］ essmann f, wieder t,otto a,et al. gdp dissociation inhibitor d4-g di(rho-gdi2), but not the homologous rho-gdi1,is cleaved by caspase-3 during drug-induced apoptosis. biochem j,2000,346:777-783.
［4］ 许欣,彭林涛,刘丽华,等.食管上皮癌变过程中fas、fasl、fadd和caspase-8的表达及其意义.基础医学与临床,2007，5（27）：525-529.
［5］ 张永香.108例晚期食管癌的药物治疗与分析.中国现代药物应用,2010(14):109-110.
［6］ 庞东生.紫杉醇联合奈达铂和氟尿嘧啶治疗晚期食管癌的临床观察.临床肿瘤学杂志,2010,15(2):169-170
［7］ 侯俊民, 束永前, 赵志泉.紫杉醇对人食管癌eca109细胞株生长的影响. 南京医科大学学报,2001,3(21):235-238.
［8］ muzio m, chinnaiyan am, kischkelfc, et al．flice，a novel fadd homologous ice/ced-3-1ike protease，is recruited to the cd95(fas/ap0-1)death-inducing signaling complex．cell, 1996,85(6):817-827.
