摘要】 目的 以去卵巢大鼠建立更年期动物模型，探讨维生素e(ve)对心肌细胞保护作用机制。方法 正常成年大鼠和注射植物油的去卵巢大鼠为对照组；腹腔注射ve的去卵巢大鼠为实验组，分别为：5 mg/kg（小剂量组）、15 mg/kg（中剂量组)、60 mg/kg(大剂量组)，连续注射9周。采用黄嘌呤氧化酶比色法、硫代巴比妥酸法测定血清中总超氧化物歧化酶(tsod)活力和血清丙二醛(mda)含量水平，免疫组织化学法检测bcl2、bax蛋白表达。结果 各ve剂量组血清tsod活力均高于去卵巢大鼠对照组，mda含量低于去卵巢大鼠对照组，且bcl2/bax比值有随剂量增加呈递减趋势。结论 ve可增强血清tsod活力，下调bax蛋白表达，上调bcl2蛋白表达，抑制更年期大鼠心肌细胞凋亡。这可能是维生素e对绝经后妇女心血管保护作用的机制之一 。
【关键词】 维生素e tsod mda bcl2 bax
influence of vitamin e on apoptosis of cardiac muscle cells in ovariectomized rats
wang yuepeng1,zhao xingyu2,lu changzhu3,yao lanchun1* (1.department of physiology,harbin medical nuiversity,harbin，heilongjiang province,150081；2.department of physiology,jilin medical college，jilin city,jilin province,132013；3.department of physiology，qiqihar medical nuiversity，qiqihar,heilongjiang province,161042,china)
abstract:objective the ovariectomized rats were used as climacteric period animal model.the protective function and the mechanism of ve on the cardiac muscle cells of the ovariectomized rats were discussed. methods the contrast group was the normal adult rats and the ovariectomized rats injected by plant oil，the experiment group was the rats extirpated ovaries who were injected ve in its′ abdomen antrum：5 mg/kg，15 mg/kg，60 mg/kg ve was injected to the experiment group for continuous 9 weeks．tsod，mda，bcl2 and bax were determined by the colorimetric method，the thibarbituric acid method and the immunity group chemical method. results compared with the negative control group，the activity of tsod in serum were upregulated；the content of mda in serum was all degraded．bcl2/ bax weakened gradually along with augmentation of the dosage. conclusion ve could improve the activity of tsod，reduce expression of bax and improve expression of bcl2．it could also restrain the death menopause rats′ cardiac muscle cells.
key words:ve;tsod;mda;bcl2;bax
绝经后女性身体各器官出现明显的衰老加速，发病率逐渐上升，研究表明雌激素水平下降是中老年女性患心血管疾病增加的主要原因。Www.11665.CoM使用雌激素替代疗法(ert)后许多生理功能保持相对稳定，延缓了衰老，特别是使心血管系统疾病的发生减少，程度减轻。但其引起阴道出血、乳房胀痛等不良反应及中远期致子宫内膜癌、乳腺癌等副作用无法排除，使其应用受到一定的限制。资料表明，ve作为有效的抗氧化剂可起到保护细胞、延缓衰老的作用。本研究用去卵巢大鼠，给予不同剂量的ve，观察和研究ve对老年大鼠心血管系统的影响，进一步寻求和探讨对心血管细胞的保护作用的途径和机制。
1 材料与方法
1.1 试剂及样品
维生素e注射液购于上海通用药业股份有限公司；植物油为食用色拉油；兔多克隆抗bax抗体、鼠单克隆抗bcl2抗体及dab染色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2 动物分组与模型制备
wistar成年雌性大鼠40只，10月龄，体重(230±20)g ，由吉林大学白求恩医学部实验动物中心提供。大鼠随机分成5组：正常对照组、去卵巢对照组、去卵巢小剂量组、去卵巢中剂量组、去卵巢大剂量组。
大鼠适应性喂养普通饲料1周后，除正常对照组外，各组大鼠以1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，背位固定，无菌状态下，做腹正中切口，找到双角子宫，分别沿每侧子宫找到卵巢，分离后结扎切除，分层缝合关闭腹腔。大鼠去卵巢1周后，阴道涂片，已无性周期变化。各组大鼠继续喂养普通饲料，对照组大鼠腹腔注射植物油，实验组大鼠按5 mg/kg、15 mg/kg、60 mg/kg腹腔注射维生素e，每日1次，持续9周。
1.3 血清学指标的测定
实验结束时，实验动物均眼底静脉取血，血清置-20℃冰箱保存待测。采用黄嘌呤酶法测定血清总超氧化物歧化酶(tsod)活力。每毫升反应液中sod抑制率达50%时所对应的sod量为一个活力单位。测定时每份血清样品取20 μl，按试剂盒说明书操作，结果以活力单位/毫升（u/ml）表示；采用硫代巴比妥酸法测定血清丙二醛(mda)含量，操作按说明书进行，样品取0.1 ml，结果以nmol/ml 表示。
1.4 免疫组织化学法检测bcl2、bax蛋白表达
取心肌相关组织切片，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水后，采用免疫组织化学法检测大鼠心肌细胞bcl2、bax蛋白表达。dab显色，细胞浆染成棕黄色的即为阳性细胞。
1.5 统计学分析
实验数据用均数±标准差（±s）表示，采用 spss 11.0统计软件包，先进行方差齐性检验， 再行oneway anova和studentnewmankeuls(snk)检验。
2 结 果
不同组间血清中tsod活力、mda含量比较见表1。由表1可见，去卵巢对照组sod活力水平低于正常对照组（p<0.05），小、中、大ve剂量组sod活力水平呈递增趋势，且均高于去卵巢对照组。去卵巢对照组mda含量显著高于成年对照组（p< 0.01），小、中、大ve剂量组mda含量呈递减趋势，且均显著低于去卵巢对照组（p<0.01）。
心肌细胞中bcl2、bax蛋白表达见表2。各组大鼠的心肌细胞均可见到bcl2、bax基因蛋白的阳染细胞，均为胞浆着色，呈棕黄色颗粒，阴性对照无着色。去卵巢对照组bcl2表达较低，bax表达最高，bcl2/bax比值最小；各剂量组较去卵巢对照组bcl2表达逐渐升高、bax表达逐渐降低， bcl2/bax比值随ve剂量逐渐加大而增大。表1 各组大鼠血清sod活力和mda含量与正常对照组比较，p<0.05；**与正常对照组比较，p<0.01；#与去卵巢对照组比较，p<0.01
3 讨 论
维生素e又称生育酚，是人体内具有广泛生理功能的重要脂溶性维生素和抗氧化剂，可对抗自由基的破坏，降低不饱和脂肪酸的过度氧化，防止脂质过氧化物的形成，保护细胞膜，稳定心肌细胞［1］。在动物和人体内，氧化应激损伤与自由基毒性在心血管系统发病中的作用，已经引起人们的重视和广泛的研究。自由基在机体内通过酶系统与非酶系统产生，其表2 各组大鼠心肌bcl2、bax蛋白od值，与bcl2/bax比值*与去卵巢对照组比较，p<0.05；**与去卵巢对照组比较，p<0.01；#与正常对照组比较，p<0.01
攻击生物膜中多聚不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物及其分解产物，触发细胞凋亡，而mda是脂质过氧化物中毒性最大的一种,能破坏膜结构和膜蛋白功能,影响核酸的功能和代谢,造成遗传信息改变［2］。因此mda的测定可反映机体脂质过氧化的程度,间接反映出机体组织、细胞损伤的程度。在哺乳类动物体内有两种自由基清除系统，即酶促体系(如sod、gshpx等)和非酶促体系(如维生素c、vite、还原性谷胱甘肽等)。本实验去卵巢对照组血清tsod的活力下降、mda含量升高，提示衰老大鼠机体的酶促防御体系功能下降，且机体有明显自由基损伤。实验中发现随ve剂量的增加，各剂量组血清tsod的活力有所增高、mda含量明显降低。提示ve不仅通过非酶促体系发挥抗氧化作用，还可激活酶促体系抗氧化因子，通过提高内源性抗氧化物质的水平，降低自由基对组织的损伤。此外,维生素e还可通过调节相关基因的表达［3］等多渠道减缓心血管系统多种疾病的发生。
凋亡是细胞在各种死亡信号刺激后发生的一系列瀑布式激活的主动性细胞死亡过程［4］，其发生受促进性和抑制性双向因素的共同调节。bal2和bax分别是抑制和促进细胞凋亡功能相反的两类蛋白质［5］。bax蛋白是一个可溶性蛋白分子，主要位于细胞浆中，当bax在细胞内超表达时，细胞对死亡信号的反应增强，细胞死亡增多；bcl2蛋白分布于线粒体外膜的胞浆面、内质网表面及核膜上，具有稳定线粒体膜的功能，当bal2超表达时，它与bax形成异二聚体，死亡被抑制［6］。因此，bcl2和bax的比例可决定细胞凋亡的敏感性。本实验中，各剂量组较去卵巢对照组bcl2/bax比值随ve剂量逐渐加大而增大，说明不同剂量的ve可以减少心肌细胞的凋亡,尤以大剂量ve(每天60 mg/kg)效果显著，接近成年对照组比值水平。提示一定剂量的维生素e可正性调节bcl2/bax的比值，抑制细胞凋亡，保护心肌细胞。
目前，由于维生素e对心血管保护机制尚未完全清楚，对其能否替代雌激素，降低老年女性心血管系统疾病的发生、排除各种副作用尚不可预料。本研究表明，一定剂量的维生素e，可增强血清tsod活力，显著降低mda含量水平，下调bax蛋白表达，上调bcl2蛋白表达，从而抑制老年雌性大鼠心肌细胞的凋亡，达到对心肌细胞的保护作用。而对此进一步的研究有助于维生素e心血管保护作用机制的阐明，为更年期后女性心血管疾病的研究与治疗提供理论基础。
【参考文献】
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