【摘要】 目的：建立四环素调控的小鼠lair1/cd305转基因小鼠，为进一步研究mlair1分子的体内功能奠定基础。方法：构建pbi5mlair1载体，显微注入b6d1f1受精卵，pcr检测新生小鼠基因组dna中lair1与荧光素酶（luciferase）基因。将mlair1和荧光素酶双阳性小鼠耳成纤维细胞转染含rtta的puhd17.1质粒，用含盐酸强力霉素（dox）的培养基进行培养，检测细胞裂解液中荧光素酶活性。将荧光素酶表达依赖dox小鼠与c57bl/6交配，采用pcr对子代鼠进行检测。结果：共获得9只首建鼠，其目的基因表达高度依赖dox，并得到其中5只首建鼠的f1代小鼠。结论：获得了四环素调控的小鼠lair1转基因小鼠，可用于该分子体内功能的研究。
【关键词】 小鼠lair1 转基因小鼠 四环素调控表达系统
generation of conditional tetracyclineregulated transgenic mice overexpressing mlair1
fang liang，miao jun，han weining，zhang yuan，zhang ruizhong，zhang xinhai，zhuang ran，jin boquan.
department of immunology, fourth military medical university, xi’an 710032, china
［abstract］ objective:to generate the conditional tetracyclineregulated transgenic mice overexpressing mlair1.methods:the mlair1 expression vector was constructed by recombination of pcdna3mlair1 and pbi5.transgenic mice lines were generated by pronuclear injection by using standard techniques.positive animals were selected based on analysis of dna sequence from mice tail by pcr.the controlled regulation of the integrated expression unit was tested by transfecting primary mouseear fibroblasts obtained from dnapositive founders with the rtta plasmid puhd17.1.founder animals that showed doxdependent expression of luciferase were selected and interbred with c57bl/6 mice to establish a defined genetic background.results:we created transgenic mice in which the expression of both mlair1 and luciferase cdna were under the control of the bidirectional promoter pbi1.among 13 founder animals carrying the mlair1 transgene, 9 founders regulated luciferase in response to dox as monitored in primary fibroblast cultures.5 lines were established after interbreding with c57bl/6 mice.conclusion:the conditional tetracyclineregulated transgenic mice overexpressing mlair1 have been established successfully which may provide an useful animal model for investigating the function of mlair1 molecule in vivo.
［key words］ mlair1；transgenic mice；tetracyclineregulated gene expression system
人白细胞相关免疫球蛋白样受体1（human leukocyteassociated iglike receptor1, hlair1）分子是一种免疫细胞抑制性受体，胞浆区含有2个itim基序，表达于多种免疫细胞上，能明显抑制nk细胞和t细胞功能［1］。wWW.11665.CoM在2004年12月召开的第八届国际人类白细胞分化抗原会议（hlda 8）上，lair1被命名为cd305［2］。lair1/cd305分子相应的配体尚未鉴定，该分子的体内功能还不清楚。我室于2002年首先克隆了hlair1在小鼠体内的同源分子mlair1（af479685，genbank），其广泛表达于小鼠多种免疫细胞表面［3］。四环素调控系统作为一种条件转基因技术，可克服传统转基因技术的缺点，能精细地在动物不同的发育阶段和特定组织内诱导目的基因表达，进而研究其功能［4］。本研究应用四环素调控系统，制备可过高表达mlair1分子转基因小鼠，以期为研究免疫新分子lair1/cd305体内功能提供新的研究手段和良好的动物模型。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 pcdna3mlair1载体为本实验室构建；pbi5载体和puhd17.1质粒由德国海德堡大学bjuard教授馈赠；限制性内切酶、t4连接酶及taq dna聚合酶均购自takara公司；盐酸强力霉素（doxcycline hydrochloride，dox）为sigma产品；荧光素酶检测试剂盒购自promega公司；rpmi1640干粉购自hyclone公司；胎牛血清（fcs）购自美国gibco公司；质粒抽提和dna回收纯化试剂盒为华舜公司产品。
1.2 动物 所有实验用小鼠（spf级）均由charles river laboratories提供，并饲养于中科院上海实验动物中心的隔离器内。
1.3 pbi5mlair1载体构建 对pcdna3mlair1载体和pbi5载体分别用hind ⅲ和ecor ⅴ进行双酶切，pcdna3mlair1载体酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，回收mlair1分子全长片段（约1 500 bp）并纯化，对pbi5载体酶切产物进行快速纯化。使用t4dna连接酶对两种纯化产物在16℃连接过夜，连接产物转化感受态受体菌e.coli dh5α，以含氨苄青霉素的lb琼脂平板筛选，37℃培养过夜，挑取白色菌落增菌后提取质粒，pcr鉴定后由北京赛百胜公司进行测序［5］。对鉴定结果正确的质粒使用ase ⅰ进行酶切，产物经蔗糖密度梯度离心，纯化出6.3 kb左右的线性片段，见图1。
图1 pbi5mlair1载体构建示意图（略）
fig.1 scheme for construction of pbi5mlair1 vector
1.4 显微注射 按照常规显微注射技术要求，将纯化所得线性pbi5mlair1载体片段注入80个b6d1f1小鼠（c57bl/6小鼠和dba/1小鼠的杂交一代）受精卵内，然后移植入假妊雌小鼠。本部分技术工作由德国海德堡大学转基因中心协助完成。
1.5 新生小鼠的pcr检测和鉴定 取2周龄新生小鼠尾部组织长约0.5 cm，参照《分子克隆》中哺乳动物基因组dna提取的操作方法，提取小鼠尾基因组dna，并以其为模板，分别使用mlair1基因的检测引物5′ctg ttg tgt gct cat act ctg3′和5′gga tat acg tca cct ctt gaa g3′，荧光素酶基因的检测引物5′tta cag atg cac ata tcg agg3′和5′taa ccc agt aga tcc aga gg3′进行pcr检测，选取双阳性结果的小鼠。pcr反应条件为：94℃预变性5分钟，然后94℃ 50秒→60℃ 1分钟→72℃ 1分钟进行35个循环，最后72℃延伸10分钟。
1.6 小鼠耳成纤维细胞的体外培养 取一小块pcr检测双阳性小鼠的耳部组织（约3 mm×3 mm），在无菌条件下用刀片切成小块，立即放入含2 ml rpmi1640培养基（含30%fcs，300 u/ml的青霉素/链霉素，1 mg/ml胶原酶）的3.5 cm平皿中，消化过夜，用培养基小心吹散细胞团块后转入新平皿中培养36小时，用pbs将贴壁细胞在平皿内洗1遍后换液，继续培养3天，使其达到80%的汇合率时用于以下实验［6］。
1.7 荧光素酶活性检测 将培养的耳成纤维细胞计数后转入24孔培养板，2×105/孔，培养基中分别含有或不含dox（终浓度1 μg/ml），用含rtta的puhd17.1质粒转染细胞，继续培养30小时后按照荧光素酶检测试剂盒说明对细胞裂解上清使用luminmeter（turner design）进行检测。
1.8 ptetmlair1 f1代小鼠的建立 将荧光素酶表达活性依赖dox的小鼠与正常c57bl/6交配，所获子一代小鼠继续借助pcr进行检测，筛选出mlair1与荧光素酶双阳性的小鼠。
2 结果
2.1 pbi5mlair1载体的构建 将pcdna3mlair1载体中mlair1分子全长序列经双酶切克隆入pbi5载体中，序列测定结果正确，再经过单酶切得到了6.3 kb左右的线性载体片段，其中mlair1与荧光素酶基因都在pbi1(含有7个teto序列的双向cmv最小启动子)控制下［7］。
2.2 新生小鼠的pcr检测和鉴定 对经显微注射操作的新生小鼠基因组dna，分别使用mlair1和荧光素酶引物进行pcr鉴定，阳性小鼠同时分别扩增出552 bp和488 bp片段，共获得了13只阳性小鼠，见图2。
2.3 荧光素酶活性检测 由于荧光素酶分子与mlair1分子受pbi1双向启动子控制，因此检测荧光素酶活性可准确反映mlair1表达。pcr检测阳性小鼠耳成纤维细胞，转染含rtta的puhd17.1质粒，检测荧光素酶活性水平，共发现9只首建（founder）鼠其荧光素酶活性依赖于培养基中的dox，见图3。
2.4 ptetmlair1 f1代小鼠的建立 将所获founder小鼠与正常c57bl/6交配，其中有5只founder小鼠得到子一代小鼠，共25只，经pcr检测，有13只为阳性，阳性率约为50%，符合杂合子小鼠的遗传规律，为ptetmlair1小鼠f1代。
图2 mlair1与luciferase的pcr检测电泳图（略）
fig.2 electrophoresis of mlair1 and luciferase pcr products
note:m.dl2000 marker;1.positive control;2,3,7,9.stand for negative mice;46,8,10.represent positive mice;11.negative control.
图3 荧光素酶活性的检测（略）
fig.3 detection of luciferase activity
note:no.19.founder mice;no.1013.negative mice.
3 讨论
mlair1属于细胞黏附分子中免疫球蛋白超家族（igsf）成员，位于小鼠7号染色体，相当于人19q13.4染色体的白细胞受体复合物（leukocyte receptor complex，lrc）内。mlair1基因编码263个氨基酸，在氨基酸水平上有40%与人lair1一致，其分子胞膜外区也含1个免疫球蛋白样结构域，胞浆区含2个itim样（itimlike）基序。体外研究表明，人lair1分子被其相应单克隆抗体交联后，可传递强烈的抑制性信号，抑制包括nk细胞、效应t细胞、b细胞和树突状细胞前体等多种免疫细胞的功能，mlair1也可通过其胞浆区itim传递抑制信号［8］。对lair1分子功能的了解均来自体外实验，目前尚缺乏有效的体内研究手段。
转基因技术已成为研究蛋白分子体内功能的重要手段，但普通转基因技术无法显示目的基因在生物发育各过程中的作用，传统的基因敲除技术由于影响生物体所有的细胞，也难以在复杂的发育过程中准确揭示产生变化的先后顺序及其规律。四环素调控的条件转基因技术可克服上述缺点，利用对生物体无害的四环素及其衍生物，在不同组织或不同发育阶段诱导目的基因高表达，从而研究其功能变化［9］。同时，由于外源基因在宿主染色体基因组上插入的位置不同，可能对目的基因在体内表达产生不同程度影响，甚至产生无效的转基因小鼠。我们构建的载体中，mlair1和荧光素酶报告基因由teto双向启动子通过tet同时调控，因此可使用含rtta的puhd17.1质粒转染小鼠耳成纤维细胞后，通过检测报告基因荧光素酶，有效检出mlair1分子的表达水平。
本研究成功获得四环素调控的mlair1分子转基因小鼠（ptetmlair1），可用于同携带免疫组织特异性启动子（如μetta、eμsrtta等）的小鼠交配，使用四环素及其衍生物调控子代双转基因小鼠的mlair1在胸腺、脾脏等免疫器官表达，从而观察lair1在免疫系统发育中的作用［10，11］。
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