人类辅助生殖技术中的胚胎培养与筛选

【关键词】  辽宁沈阳，沈阳204医院生殖医学研究中心

随着生殖生物学领域的不断拓展，人类辅助生殖也相应得到了飞速的发展，自世界首例体外受精-胚胎移植(ivf)婴儿诞生以来［1］，该技术已开展了约三十年。但是，尽管ivf已成为目前治疗不孕不育的完善方案，其成功率仍然较低。大部分的胚胎死亡似乎发生在移植前的培养阶段，仅有50％的体外培养胚胎能在第六天发育到囊胚阶段［2］，移植后的胚胎发育为胎儿的比例也不足15％。为了提高妊娠率，将多个胚胎一同植入时，却导致了多胎妊娠率的大幅升高。因此，如何通过改善培养条件、优化配子质量和开发新的胚胎筛选技术以提高胚胎种植率一直是辅助生殖实验室研究人员所关注的焦点和努力的方向。

    1  胚胎的体外培养

    在过去的十多年里，人们已经认识到通过优化培养基，可以改善ivf胚胎的体外发育和胚胎的植入率。通过降低培养基中葡萄糖的浓度、添加氨基酸和生长因子可以提高囊胚形成率和细胞数。在ivf胚胎的培养基成分改良上，已经没有多大的研究空间。据报道，即使使用无葡萄糖培养基来改进胚胎质量，妊娠率也没有升高［3］。

    人类胚胎在植入前的发育期间，营养需求的变化为：卵裂早期主要是对丙酮酸的需要，随着发育的进行，逐渐转变为囊胚期对丙酮酸和葡萄糖都有较高的需要。WwW.11665.com受精卵在早期发育阶段从输卵管移动到子宫，发育所处的体内环境发生了变化，因而导致了胚胎营养需求的上述变化，也因此促成了囊胚阶段培养基和序贯培养基的问世［4］。随着这些新型培养基的出现，新的胚胎筛选技术也接踵而来。

    2  胚胎的筛选

    2.1  植入前胚胎的遗传学诊断（pgd）  pgd是在胚胎植入子宫前对其进行遗传性障碍的诊断。pgd可以降低父母将遗传性疾病传给子女的风险。常规的胎儿诊断是在妊娠12~16周，通过绒毛膜绒

    毛样本或羊膜穿刺术对胎儿进行检查。如果胎儿有遗传缺陷，夫妻双方就要考虑终止妊娠。一种替代途径是，从ivf后的8-细胞阶段胚胎中取出1～2个卵裂球，用荧光原位细胞杂交融合（fish）或pcr对这些细胞进行分析，确定有遗传缺陷的胚胎。只有那些通过pgd检查无遗传缺陷的胚胎才能植入子宫，这样就避免了妊娠终止。第一例通过此项技术的试管婴儿出生于1990年［5］，之后通过pgd检查出生的健康孩子已超过150个。

    fish可以对处于分裂间期或中期的完整细胞核中的特殊染色体进行检查，以鉴别胚胎的性别（这对于避免x-染色体的伴性遗传疾病十分重要）和检查染色体的非整倍性(如down氏综合征)和主要的染色体畸形(如染色体易位)［6］，而用pcr技术扩增特殊的基因序列可以对单个基因的进行检查［5］。尽管用于pgd的单细胞pcr诊断具有极高的敏感性，但其精确性和可靠性仍会受到扩增失败、污染和等位基因缺失等因素的影响，所以新的pcr方法正在被不断研究评估当中。经过有效的pgd循环，大量的卵母细胞都需要回收处理，因为并不是所有的卵母细胞都会受精、卵裂，进行有效的活体检查并被确定为适于移植。

    自从这项技术被首次应用于临床［5］，对人类胚胎的更深入检查就显示了胚胎中细胞间的差异性是普遍存在的，包括相邻的正常细胞和异常细胞。在4日龄的人类胚胎中，约有60%的胚胎含有一个或多个双核细胞，约40%的胚胎含有染色体异常的细胞，包括单倍体、多倍体和非整倍体［7］。这种镶嵌性对pgd的准确性有严重的影响，因为通过胚胎生物观察取出的那个用于分析胚胎的细胞，并不一定代表胚胎中其余细胞的状态［5］。许多研究组从8-细胞胚胎中取2个细胞进行分析，以加强诊断的可靠性，但是我们应该认识到50%以上的pgd都是用于伴性遗传疾病的诊断，并且是在性别的基础上做诊断。在这种情况下，镶嵌性不一定会导致诊断错误，因为一个胚胎只可能是男性或女性，与镶嵌性无关。总的来说，fish使用多探针进行检测，在分析中一定能够观察到两个x标记或一个y和一个x标记（还有一个用以确定倍性的常染色体标记），以精确诊断性别。

    用基因产物（mrna）而不是基因本身进行胚胎遗传缺陷诊断的可能性正在研究中。这项研究涉及开发高灵敏度的rt-pcr技术，应用于单个卵裂球中的rna的分析。目前仅从卵母细胞胞质中取样而不是整个卵裂球中获得足够确诊胚胎缺陷的mrna的研究有望取得成功［8］，但是，母体卵母细胞中的rna的存留时间超过了胚胎基因组启动的时间，这可能会对诊断造成影响，而且相应的技术也尚未成熟。

    2.2  胚胎非整倍性的筛选  在妊娠第7周发生自然流产的病例中，胎儿染色体异常的发生率＞60%，显著高于同期引产胎儿的3%～9%的发生率［9］。这一发现提示，胚胎的非整倍性是导致移植失败进而使ivf成功率低的主要原因。在形态正常的人类体外发育胚胎中，20%左右患有不同程度的染色体异常，且这种异常导致了植入前胚胎的凋亡，大约70%的凋亡胚胎是异常胚胎［7］。在试图提高移植率的探索中，进行移植前胚胎筛选的可能性越来越引起人们的关注，尤其是对那些年龄较大的患者和ivf反复失败或习惯性流产的女性，移植前胚胎筛选更为重要。

    研究已表明fish技术结合胚胎的活体检查可以显著提高妊娠率［10］，尽管fish在提供间期细胞核信息的方面有很大的优点，但仅有有限数量的染色体可以随时进行分析。因此，目前从细胞中获得完整的染色体信息的最有效方法是选取染色体组型最明显的中期的细胞核继续分析，但到目前为止从单个卵裂球细胞获得中期信息的常规方法仍有相当高的技术要求，这使得中期的可分析比率非常小。然而将卵裂球细胞与一个完整的或去核的哺乳动物卵母细胞融合，则可以在＞90%的情况下产生明显的中期［11］。随着光谱图像的进步，对单个细胞中的23条染色体或极体的分析得以实现。这项技术允许对染色体数量上和结构上的异常进行检查，且无需借助探针，也就省去了复杂的生产特殊化探针的过程。

    与pgd一样，上述方法也存在同样的问题，那就是用于分析的细胞相对于整个胚胎的代表性有多大。近乎40%的人类胚胎存在镶嵌现象［7］，即形成含有正常的二倍体卵裂球与异常的非整倍体卵裂球的混合体。这些非整倍体细胞以后的命运还有待进一步的研究，因为它们在胚胎发育中将在何时以怎样的方式被淘汰还不得而知。

    随着年龄的增长，卵母细胞非整倍性的发生率不断升高，这被认为是造成ivf成功率随年龄下降的主要原因。因此，对年龄较大的女性来说，用胚胎遗传疾病的移植前诊断技术对非整倍胚胎进行筛选，是很好的提高妊娠率的方法。

    2.3  卵母细胞质量的筛选  van blerkom等［12］曾提出小鼠和人类的早期胚胎的发育活力与线粒体的代谢能力有关。他们认为，胚胎自身的线粒体的复制要到着床以后才开始，而父本的贡献又很小，所以植入前胚胎完全依靠母体通过卵母细胞遗传下来的线粒体提供能量［12］。卵母细胞中mtdna的缺失和突变可能会引起线粒体功能障碍，影响能量生产，使卵母细胞和早期胚胎凋亡，导致染色体片段发生畸变或胚胎发育终止［12］。

    为了提高ivf反复失败的女性的卵母细胞的质量，将mⅱ期的供体卵母细胞的胞质移植到成熟的受体卵母细胞中，以使发育不良的卵母细胞和胚胎恢复正常的生长能力。cohen等［13］报道了第一例胞浆移植试管婴儿的诞生，此后，全世界有30多例胞浆移植试管婴儿相继诞生［14］。但后来有报道指出，在同系列的17个胞浆移植胚胎里有2个胚胎出现染色体组型异常，只有45条染色体，一条x染色体缺失(x0) ［14］，因此，这项技术的安全性开始引起广泛重视。而且，发育中的胚胎应该是三个基因型的组合体，即来自父母的细胞核遗传物质以及来自供体的部分或全部的线粒体遗传物质。不仅如此，供体卵母细胞还可能引起mtdna的重排，应该将这类胚胎淘汰。当然，在细胞核移植和胞浆移植应用于常规的临床实践以前，还需要做更多的实验性工作。

    细胞核移植的目的也是治疗线粒体疾病［15］，对于因卵母细胞质缺陷造成反复性胚胎死亡的女性，可采用细胞核移植技术，将其mⅱ期卵母细胞的核体取出，植入去核的供体卵母细胞中，以弥补其细胞质的缺陷。

    3  胚胎的移植

    提高妊娠率的一种途径就是更准确地选择具有发育潜能的胚胎。一种方法是在ivf后的第2天或第3天进行胚胎移植，此时胚胎处于2~8细胞阶段。将胚胎按照形态学标准和发育速率进行筛选，挑选发育最快且形态最佳的胚胎用于移植。尽管胚胎的形态与囊胚的形成率以及胚胎的着床有一定的相关性，但仅凭形态和发育速率来挑选胚胎仍是一种不准确、不理想的方法，因为单凭可视的早期卵裂情况还不能准确的反映胚胎的继续发育潜能。另一种方法是将胚胎培养5～6天，形成囊胚后进行移植，这样既能进一步的判断胚胎的发育潜能，同时也能保证胚胎与子宫内膜之间的同步性。已经有研究证实，染色体异常的早期卵裂期的胚胎发生凋亡的几率非常大［7］，不能顺利着床。然而，尽管只有小部分的人类囊胚存在全部染色体异常的情况，但很多囊胚中存在很大比例的异常细胞，并且容易出现嵌合体现象［16］。

    囊胚移植的临床妊娠率各中心报道不一，一般都在45%～65%以上［4］。而一项对1 299例患者的随机性双盲的前瞻性的研究报道，胚胎在第2天和第5天移植后的妊娠率分别为25%和28%，没有显著性差异。huisman 等［17］研究显示，胚胎在第5天囊胚阶段进行囊胚移植，每个胚胎的妊娠率为26%，而在第3天 8-细胞阶段移植，妊娠率为18%。

    在对大量本地品种的啮齿动物和牛的后代症状进行观察，发现体外培养对其胚胎的基因表达和印迹［18］的影响较大，从而推断人类胚胎的延期培养对胎儿和成人健康可能有危害。但是，最近的一项回顾性研究表明，人类胚胎的囊胚培养对婴儿的出生重并没有影响，然而对后代的性别确有影响，表现为男性胎儿的比例增加［19］。这可能是由于男性胚胎发育较快，在对第5天的囊胚进行移植时，往往选择发育较快的胚胎，从而造成了性别比例的失调。

    4  小结

    目前，ivf-et的妊娠率似乎不可能达到自然受胎率的水平，但是，更好的胚胎筛选技术的发展仍为达到自然受孕率带来了很大希望，在更准确的判断和选择有活力且遗传正常的胚胎的同时减少多胎妊娠带来的生理、心理和经济上的负担。近20年来，人类辅助生殖技术的不断发展，胚胎的体外培养技术和体外筛选技术的也不断完善，这些为提高不孕患者的妊娠率和（或）产率到来了革命性的意义。但在过去的十年中，这些技术在没有足够的动物研究做基础的情况下，就被莽撞地用于临床实践，并试图取得妊娠和活产的成功。年龄最大的ivf孩子才二十几岁，最大的冷冻胚胎和icsi孩子也才十几岁。目前还无法预知这些新技术是否会在未来的时间内对患者生育能力和人体健康造成不良影响，更无法预知对其后代的生育能力和身体健康是否有不良影响。因而，探究一系列完整便捷准确的胚胎筛选技术是值得我们辅助生殖工作者所关注和努力的。

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