【摘要】 目的 对水源水和腹泻病人标本中检测到的17株产h2s致泻大肠埃希菌进行一系列微生物学实验研究，为进一步了解该菌的流行病学特点以及临床诊断提供实验依据。方法 自1999年10月～2005年8月，从腹泻病人标本和水源水中分离的产h2s致泻大肠埃希菌，经形态学、培养特性、生化学、血清学等微生物学鉴定，并且对菌株进一步进行了药敏试验和噬菌体裂解试验。结果 在腹泻、食物中毒病人标本和水源水中分离到17株产h2s致泻大肠埃希菌，经血清学分型后，其中4株是epec o128：k67，etec o25：k19和etec o16：k15分别为3株，占58.8%。结论 产h2s致泻大肠埃希菌与大肠埃希菌有密切的亲缘关系，是变异的致泻大肠埃希菌，在致泻大肠埃菌中占有较高的比例。致泻大肠埃希菌产h2s生化变异提示我们在注意生化反应典型的致病菌分离与鉴定时，还应注意生化变异菌株的检测和鉴定，防止该菌造成新的腹泻病的传播和蔓延。
【关键词】 腹泻; 大肠杆菌; 微生物学
discovery of and study on 17 strains of diarrheagenic e. coli of producing h2s chang hongwei1，2, zhao jun2, ding yerong1, wang mingli2. 1.lu'an center for disease control and prevention, lu'an 237008, china; 2.department of microbiology, anhui medical university, hefei 230032, china
【abstract】 objective to investigate the significance and epidemiological value in clinical practice regarding the 17 strains of diarrheagenic e. coli of producing h2s. methods various serotypes of diarrheagenic e. coli of producing h2s were separated from samples of different time. having beng preliminarily identified through morphology, cultural characteristic, biochemistry, serology, etc, some of them were further tested by drug sensitivity and phage typing. results 17 strains of diarrheagenic e. coli of producing h2s were separated from diarrhea and water resources. 4 strains belonged to epec o128: k67,etec o25:k19 and etec o16: k15 had 3 strains, accounting for 58.8%. conclusions diarrheagenic e. coli of producing h2s has close consanguinity with diarrheagenic e. coli, and they are variant diarrheagenic e. coli, accounting for relative high proportion. biochemical variation by which diarrheagenic e. coli produce h2s shows that we should not only pay attention to pathogenic bacterium of typical biochemical reaction, but also to biochemical variant strains of bacterium when carrying out isolation and identification of bacterium. due to the fact that they have very strong pathogenicity. they should be taken seriously with measures adopted for prevention.
【key words】 diarrhea; escherichia coli; microbiology
大肠埃希菌，通称大肠杆菌，是人及多种动物肠道中的正常寄居菌，婴儿及新生动物常在出生后几小时，即有大肠杆菌从口腔进入消化道，寄居于消化道后段大量繁殖，并终生存在，构成肠道正常菌群的组成部分[1]。wWw.11665.COm但是随着检测手段的不断发展，人们逐渐认识到某些血清型大肠杆菌也能够引起腹泻[2,3]和食物中毒[4]等疾病。致泻大肠杆菌有肠致病性大肠埃希菌(enteropathogenic e coli，epec)、肠产毒性大肠埃希菌(enterotoxigenic e coli，etec)、肠侵袭性大肠埃希菌(enteroinvasive e coli，eiec)、肠出血性大肠埃希菌(enterohemorrhagic e coli，ehec)和肠聚集性大肠埃希菌(enteroaggregative e coli，eaggec)五类，主要侵害胃肠道，引起肠道感染，以程度不同的腹泻为共同的临床症状[5]。致泻大肠埃希菌具有大肠杆菌一般的生物学特征，能分解葡萄糖、乳糖产酸产气，不产生h2s，不分解尿素，imvic试验为“+、+、-、-”和miu试验为“+、+、-”，氧化酶阴性，触酶阳性。由于细菌变异性的存在，在临床细菌学检查工作中，经常会遇到一些不典型的细菌。自1999年10月～2005年8月，笔者从腹泻病人标本和水源水中陆续分离到17株产h2s致泻大肠埃希菌，并对其生化学、抗原性、耐药性和致病性等微生物学性状进行了一系列研究，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源
1.1.1 粪便 六安市人民医院肠道门诊腹泻病人和本市范围腹泻和食物中毒病人粪便标本，采样后在4 h内送检。
1.1.2 水源水 在该市主要饮用水源新、老淠河和九墩塘分别设两个采样点，每点上、中、下间隔100 m左右，各采集水样1份，共18份水样，在2 h内送检。每月一次，常年监测。
1.2 培养基与试剂 肠道增菌肉汤、营养肉汤、伊红美兰琼脂(emb)、营养琼脂、克氏双糖铁琼脂(kia)系浙江杭州天和微生物试剂厂生产;ss琼脂购于天津东方卫生材料厂;山梨醇麦康凯琼脂、mec增菌液购于北京陆桥商检新技术公司;新霉素mec培养基购于上海试剂供应研究中心;肠杆菌科细菌生化编码鉴定管gyz—15e购于杭州天和微生物试剂厂，以上试剂均在有效期内使用。
1.3 诊断血清 肠道致病性大肠埃希菌诊断血清15种;侵袭性、产毒性大肠埃希菌诊断血清16种;志贺菌属诊断血清21种;沙门菌属诊断血清30种，以上诊断血清均为卫生部成都生物制品研究所研制;ehec o157：h7大肠杆菌单克隆抗体诊断血清(冻干)，中国预防医学科学院流行病学微生物研究所研制，用前临时配制，以上诊断血清均在有效期内使用。
1.4 肠杆菌科诊断用噬菌体 包括oi、c、sh、e、ce、e4和ent 7种，购于广州虎克生物技术有限公司，在有效期内使用。
1.5 药敏纸片 氯霉素等10种药物敏感纸片，购于浙江杭州天和微生物试剂厂，在有效期内使用。
1.6 实验方法
1.6.1 粪便标本 粪便与肠道增菌肉汤按1：10比例加入，置37 ℃中培育18～24 h后，挑取培养液适量，划线接种emb琼脂和ss琼脂，37 ℃ 18～24 h后作分纯培养。挑取平板上乳糖发酵和不发酵的疑似菌落，分别接种kia，37 ℃培养过夜，以下操作参照文献[6]程序进行。
1.6.2 水源水 用无菌方法取水样10 ml加入90 ml营养肉汤37 ℃ 6 h前增菌培育后，挑取1环培养物接种10 ml肠道菌培养肉汤中，42 ℃培养18 h，挑取增菌液适量，接种emb琼脂，37 ℃ 24h分离培养，以下操作同粪便标本。
1.6.3 噬菌体裂解试验 按文献[7]程序进行。
1.6.4 药物敏感试验 采用改良kirbybauer法[8]。
2 结果
2.1 产h2s致泻大肠埃希菌的发现 1999年10月，安徽省国防科技工业学校发生腹泻病暴发流行，课题组采集了腹泻病人、饮食服务行业人员和密切接触者粪便标本199人份，检出鲍氏4型志贺菌2株，致泻大肠埃希菌8株，其中20#标本同时产生h2s，后经血清学分型为epec o128：k67，经权威实验室成都生物制品研究所鉴定确认为产h2s致泻大肠埃希菌。
2000年5月，课题组在水源检索中分离到1株g杆菌,有动力、氧化酶阴性，靛基质阳性，在kia上分解葡萄糖、乳糖产酸产气，产h2s明显，赖氨酸脱羧酶阴性，kcn生长试验、尿素酶试验均阴性，血清学分型为epec o128：k67[9]。
2.2 产h2s致泻大肠埃希菌的微生物学特点
2.2.1 形态与染色 产h2s致泻大肠埃希菌为革兰阴性短小杆菌，长约1～3 um，宽约0.4～0.7 um，无芽胞，有鞭毛，能运动，与普通大肠埃希菌形态一致。
2.2.2 培养特性 产h2s致泻大肠埃希菌为兼性厌氧菌，15 ℃～45 ℃ 可发育，最适培养温度为37 ℃，最适ph为7.4～7.6;对营养的要求不高，37 ℃ 24 h培育后，在营养肉汤中呈均匀、混浊、丰盛生长，在表面形成菌膜，混匀时可见管底有粘液样沉淀;在普通培养基上生长良好，形成直径2～3 mm圆形，凸起、湿润、光滑、灰白色、半透明、边缘整齐的菌落;在ss琼脂上也能生长，但菌落较小，直径在0.5～0.8 mm，红色(分解乳糖产酸)，圆形、凸起、湿润、光滑、不透明、边缘整齐;在emb琼脂上，中等大小，直径1.3～1.6 mm，圆形、光滑、湿润、边缘整齐，凸起、不透明的紫黑色菌落，并带有明显的金属光泽;在血琼脂上，菌落为圆形、光滑、湿润、凸起、不透明，中等大小，直径1.5～1.8 mm，不溶血，边缘整齐呈乳白色。
2.2.3 生化反应 产h2s致泻大肠埃希菌能迅速分解多种糖类，包括葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇等产酸产气，不分解尿素，vp试验阴性，不能利用枸椽酸盐作为碳源，甲基红试验阳性，有明显动力，与普通大肠埃希菌一样，唯一不同的是能够产生h2s。在进行课题研究中，分别从人粪便和水源水中检出致泻大肠埃希菌143株和149株。而其中产h2s致泻大肠埃希菌分别为8株和9株，其所占百分率分别为5.6%和6.0%，差异无统计学意义(χ2=0.026，p>0.05)。
2.2.4 血清学分型 产h2s致泻大肠埃希菌抗原复杂，常发生交叉凝集反应。为确定分离菌株的抗原性和凝集效价，笔者选择了不同时间、不同标本中分离的3株产h2s菌株报送国家权威实验室成都生物制品研究所鉴定，结果3株菌血清型分别为epec o128：k67(2株)和etec o25：k19(1株)，确认为同型的产h2s致泻大肠埃希菌。课题组陆续发现的17株产h2s致泻大肠埃希菌经肠道致病性大肠埃希菌诊断血清分型为9个血清型，其中epec o128：k67有4株，etec o25：k19和etec o16：k15分别为3株，占总数58.8%(表1)。表1 17株产h2s致泻大肠埃希菌血清分型
2.2.5 噬菌体鉴定 按文献[7]要求制备1.2%营养琼脂平板和试验菌液。每株试验菌涂抹7个菌斑，用定量乳头滴管(每滴0.01 ml)在菌斑上依次滴加oi、c、sh、e、ce、e4和ent噬菌体各1滴，略等数分种，待噬菌体被琼脂完全吸收。翻转平板，放36 ℃培养5～6 h并过夜观察结果。e噬菌体对5株试验菌均呈融合性裂解，sh噬菌体对40#菌和水3#菌亦呈完全透明裂解，比照噬菌体裂解诊断表，确定5株试验菌均为大肠埃希菌属。
2.2.6 药物敏感性 结果显示，产h2s致泻大肠埃希菌对药物敏感性，水源株和人源株呈现出差异(t=42，p<0.02)。水源株对氯霉素、环丙沙星、新霉素、菌必治均呈现高度敏感性，而人源株对其呈现高度敏感性仅为57.1%(4/7)、42.9%(3/7)、85.7%(6/7)、85.7%(6/7)。水源株对丁胺卡那、先锋v、庆大霉素、痢特灵和氟哌酸也呈现较好的敏感性，其高敏感株分别为83.3%(5/6)、67.7%(4/6)、83.3%(5/6)、83.3%(5/6)、83.3%(5/6)，人源株其高敏感株为85.7%(6/7)、28.6%(2/7)、71.4%(5/7)、85.7%(6/7)、42.9%(3/7)，所有产h2s致泻大肠埃希菌对复方新诺明均呈现出耐药性。
3 讨论
产h2s致泻大肠埃希菌的发现是对传统生化鉴定的一项挑战，课题组在进行“致泻大肠埃希菌在水源水中的分布规律与腹泻病关系的研究”中，发现产h2s致泻大肠埃希菌在致泻大肠埃希菌中占有相当大的比重，达到5.6%～6.0%，远远高于文献中报道的1%[10]。提示以后在临床检验中要高度重视产h2s大肠埃希菌的存在，如果按传统的微生物鉴定程序，将会将很多产h2s的致泻大肠埃希菌排除在致泻大肠埃希菌之外。
一般情况下,大肠埃希菌初步鉴定,凡尿素(+)，阿拉伯糖(-)，h2s(+)者弃之[6]。但通过此次监测发现产h2s致泻大肠埃希菌在致泻大肠埃希菌中占有相当大的比例，这可能是由其它一些产h2s肠道杆菌通过接合作用将质粒转给大肠埃希菌，在接合过程中，除质粒本身能从供体菌向受体菌转移外，有的质粒还能带动供体菌染色体基因向受体菌转移。最终导致大肠埃希菌产生h2s，这种接合作用广泛存在于肠道菌科[11]。肠道杆菌易出现变异菌株，肠道杆菌的易变性在其致病力、细菌学诊断，以及预防和治疗中具有重要意义。
从产h2s致泻大肠埃希菌的药物敏感试验结果来看，其人源株和水源株耐药性有很大差异。水源株只有1株对磺胺甲恶唑、庆大霉素和氟呱酸产生耐药，而其他菌株除磺胺甲恶唑耐药外，对其他药物均为中度以上敏感，同时也不排除1株水源株可能来源于人源株污染所致。人源株对药物呈低度敏感或耐药远高于水源株，这可能是人源株应用某种抗生素治疗，该菌发生变异后，成为对该药产生耐受性。细菌的耐药性变异已成为当代医学的重要问题[12]。从事实提示[13]，菌株耐药是由一种遗传物质从一种细菌转移至另一种细菌。现已证明该耐药性与r质粒有关，此质粒尚带有毒力基因，所以致病性也强[14]。提示在疾病预防控制工作中对水源和人源引起的腹泻病或食物中毒中要采用不同的防治措施。
产h2s致泻大肠埃希菌的发现与研究，特别是产h2s菌株在致泻大肠埃希菌中比例的增加，要求在实际工作中要高度重视变异菌株的出现，从而为临床病人的确诊和治疗提供可靠的科学依据。产h2s致泻大肠埃希菌只是变异的致泻大肠埃希菌，除产生h2s外，其生化反应与普通致泻大肠埃希菌一样，也能引起腹泻和食物中毒[15～18]。疾控工作人员在日常检测中，要高度重视产h2s致泻大肠埃希菌的存在，关注其变异性和致病性，更好地为疾病控制工作提供科学的依据。
【参考文献】
[1] 陆德源. 医学微生物学 [m]. 第4版. 北京:人民卫生出版社, 1996.9899.
[2] 王晓峰，王源敏，黄峥，等. 一起肠道致病性大肠杆菌感染性腹泻暴发的调查分析 [j]. 中华新医学， 2003，4(8)：758759.
[3] bueris v, sircili mp, taddei cr, et al. detection of diarrheagenic escherichia coli from children with and without diarrhea in salvador, bahia, brazil [j]. mem inst oswaldo cruz， 2007,102(7):839844.
[4] 张群,赵巍. 一起致病性大肠杆菌所致食物中毒的调查报告 [j]. 中国公共卫生, 2001,17(7):635.
[5] 戴光强. 预防医学卫生检验分册 [m]. 第1版. 合肥:安徽科学技术出版社, 2001.100101.
[6] 北京市卫生防疫站编. 卫生防疫微生物检验操作规程 [m]. 第1版. 北京:北京出版社, 1991.6268.
[7] 何晓青. 卫生防疫细菌检验 [m]. 第1版. 南昌:新华出版社, 1989.656669.
[8] 叶应妩,王毓三. 全国临床检验操作规程 [m]. 第2版. 南京:东南大学出版社, 1997.556562.
[9] 丁业荣，杨杰，范玉珍，等. 产h2s致泻大肠埃希菌的发现与研究 [j]. 中国卫生检验杂志, 2003,13(6):687689.
[10] 叶应妩,王毓三,申子瑜. 全国临床检验操作规程 [m]. 第3版. 南京:东南大学出版社, 2006.804807.
[11] 戴光强. 预防医学卫生检验分册 [m]. 第1版. 合肥:安徽科学技术出版社, 2001.164.
[12] 李影林. 临床微生物学及检验 [m]. 第1版. 长春：吉林科学技术出版社， 1991.127.
[13] 陆德源. 医学微生物学 [m]. 第4版. 北京:人民卫生出版社, 1996.55.
[14] crane jk, choudhari ss, naeher tm, et al. mutual enhancement of virulence by enterotoxigenic and enteropathogenic escherichia coli [j]. infect immun， 2006,74(3):15051515.
[15] 吴萍，罗安良，蒋桂连，等. 邵阳市检出产h2s肠致病性大肠埃希菌o128:k67 [j]. 实用预防医学， 2005，12(5)：11961197.
[16] 常虹，薛镧. 粪便标本分离出1株产h2s肠致病性大肠埃希菌 [j]. 预防医学情报杂志， 2004，20(2)：206.
[17] 林平，余素飞，吴钟琪. 198株肺炎克雷伯菌和491株大肠埃希菌耐药性分析 [j]. 疾病控制杂志， 2004，8(3)：234236.
