【摘要】  目的 研究激活素a对体外培养的人肾小管上皮细胞转分化的影响。方法 取人肾小管上皮细胞株进行体外培养，分别向培养液中加入激活素a或激活素a+卵泡抑素，应用免疫组化法检测培养细胞转化生长因子β蛋白(tgf-β)的表达，以观察肾小管上皮细胞转分化的情况。结果 与对照组和卵泡抑素组相比，激活素组肾小管上皮细胞表达的tgf-β蛋白显著增多。结论 激活素a能促进肾小管上皮细胞增殖、转分化，提示激活素a可能在肾小管间质纤维化中起重要作用。

【关键词】  激活素a; 卵泡抑素;肾小管上皮细胞;转化生长因子β蛋白

　　abstract objective to study the stimulating effect of activin a on the transdifferentiation of renal tubule epithelial cells cultured in vitro.methods renal tubule epithelial cell strains were cultured in vitro; activin a or activin a plus follistatin were added into the culture solution and immunohisochemical method was applied in detecting the expression of transforming growth factorβ(tgf-β) protein in the cultured cells and the transdifferentiation of renal tubule epithelial cells was observed. result the tgf-βprotein expressed by renal tubule epithelial cells in activin a group increased much more than that in control group or in follistatin group.conclusions activin a can promote the proliferation and transdifferentiation of renal tubule cells, which suggests that activin a may play an important role in interstitial fibrosis of renal tubule.

　　keywords activin a follistatin renal tubule epithelial cells tgf-βprotein

　　激活素a(activin，act)是由性腺分泌的肽类激素，是近年来发现的重要细胞因子，具有广泛的生物学活性[1]。WWW.11665.cOMact分泌病理性地增高或降低，可以导致组织细胞分化、增生、代谢异常[2-3]。卵泡抑素(follistatin,fs) 也是由性腺分泌的糖蛋白激素,可阻断act 的生物学效应。act和fs形成体内一对天然的拮抗体，共同调节组织细胞的分化，同样，其在肾脏细胞的分化中也具有显著调控作用。故本实验观察act对人肾小管上皮细胞增殖、转分化的影响，探讨act在肾小管纤维化中的作用，为阐明肾组织纤维化的发病机制，探讨防治方法提供新的实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 细胞 人近端肾小管上皮细胞株(hk2，购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所)。

　　1.1.2 主要试剂 dmem/f12培养基(df，hyclone公司)，重组人激活素a(act-a)、卵泡抑素(fs)，(美国peprotech公司)，胎牛血清(fcs，gibco公司)，胰蛋白酶(gibco公司)，小鼠抗转化生长因子β蛋白单抗工作液(tgf-β)、sp免疫组化试剂盒、dab显色试剂盒(北京中杉生物技术公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养及传代 取hk2细胞株，加入含15%fcs的df培养基，吹打后以105/ml的细胞含量接种于细胞培养瓶中，37℃、5%co2条件下培养，3天后换液。倒置显微镜观察，待细胞融合生长为单层后，0.25%胰蛋白酶与0.02%edta1:1混合后消化、1：2传代，传至3～5代取细胞行各指标检测。

　　1.2.2 细胞增殖检测 消化指数生长期hk2细胞，调细胞密度为1×104/ml,接种于96孔平底培养板上,37℃、5% co2条件下培养48h，无血清fd培养液洗涤2次，加入不含血清、但含不同浓度(0.3～100ng/ml) 的act培养液(a组) ，换入不含血清、但含不同浓度(0.3～100ng/ml) 的fs培养液(f组)，30ng/mlact+不同浓度(0.3～100 ng/ml)fs培养液(a+f组)，含无血清培养基的空白对照组(c组)再培养48h。空白对照组和每一浓度组都重复4 孔。分别于培养结束前4h加入mtt(5mg/ml)20μl/，第48h结束培养。弃上清，加入dmso150μl /孔，振荡10min。在酶标光度计上测光吸收值,测定波长为490nm，所得光吸收值代表相应孔细胞的相对数量。

　　1.2.3 免疫组化检测tgf-β 将指数生长期细胞消化后以1×104/ml /孔接种到24 孔培养板中，37℃、5% co2条件下培养24h，无血清fd培养液洗涤2次，换入不含血清、但含不同浓度(0.3～100ng/ml) 的act培养液(a组) ，换入不含血清、但含不同浓度(0.3～100ng/ml) 的fs培养液(f组) ，30ng/mlact+不同浓度(0.3～100 ng/ml)fs培养液(a+f组)，含无血清培养基的空白对照组(c组)，再培养48h。空白对照组和每一浓度组都重复4孔。取片，冲洗，固定，冲洗，双氧水和羊血清封闭，tgf-β单抗，pbs代替一抗作为阴性对照，4℃过夜，冲洗3次，再加入二抗，37℃水浴1小时，进行dab法染色，以细胞浆出现棕黄色并高出背景，胞核呈浅蓝色的为阳性染色，采用leica-qwin图象分析系统测定每张片上的阳性单位灰度值，灰度值越高说明目标物质表达越少。

　　1.3 统计学处理 数据应用spss10.0统计软件进行分析，p < 0.05为有显著性差异。

　　2 结 果

　　2.1 act-a 对肾小管上皮细胞生长的影响 act-a对肾小管上皮细胞生长有明显的促进作用，在30ng/ml以内，呈剂量依赖性，当其浓度达100ng/ml时，促进小管上皮细胞增生的作用反而减弱(p<0.01);单独给fs对肾小管上皮细胞增生无明显影响(p>0.05);但fs能拮抗act对肾小管上皮细胞生长的促进作用，也呈剂量依赖性(p<0.01)见表1。表1 不同浓度act和fs对肾小管上皮细胞生长的影响注： *与0ng/ml比较，p<0.01; #与act组比较，p<0.01

　　2.2 免疫组化结果 免疫组化染色片采用图像分析阳性染色灰度值结果显示：act显著促进肾小管上皮细胞表达tgf-β，并呈剂量依赖关系(p<0.01);fs对肾小管上皮细胞分泌tgf-β无明显影响(p>0.05);但fs能拮抗act促进肾小管上皮细胞分泌tgf-β的作用，也呈剂量依赖性(p<0.01)，见表2。表2 免疫组化tgf-β图像分析光密度值注： *与0ng/ml比较，p<0.01; #与act组比较，p<0.01

　　3 讨 论

　　肾小管上皮细胞转分化是肾小管间质纤维化形成的重要原因，而tgf-β被公认为致纤维化的重要因子，是小管上皮细胞转分化为成纤维细胞的标志蛋白。act是新发现的tgf-β超家族成员，研究证明正常成人肾脏中几乎没有act的表达，但其天然拮抗物fs的表达却非常丰富，在急性缺血再灌注损伤的肾组织中act的表达显著上调，而fs表达明显下降[4]。这些资料提示，act可能在肾组织纤维化的发生发展机制中也起有重要作用。

　　本实验向体外培养的人肾小管上皮细胞培养液中加入外源性的act，结果发现act 在(0.3-100)ng/ml范围内呈剂量依赖性地刺激肾小管上皮细胞增殖，说明act对小管上皮细胞的刺激增生作用有一定的适应浓度范围。我们的试验还发现，act以剂量依赖方式促进肾小管上皮细胞分泌tgf-β，tgf-β的表达，是小管上皮细胞转分化为成纤维细胞的标志，说明act能刺激肾小管上皮细胞转分化，而肾小管上皮细胞转分化为成纤维细胞是其大量分泌细胞外基质，导致肾组织纤维化的始动环节。因此，研究结果说明act在肾组织纤维化的发生发展中起重要作用。

　　已经明确fs能与act不可逆地高亲和力结合，从而阻断act的作用。本实验利用fs能中和act的特性，向小管上皮细胞培养体系中加入fs，结果表明，单纯加入fs，对肾小管上皮细胞的增殖及其表达tgf-β无明显影响，但与act同时存在时，能显著抑制act对小管上皮细胞刺激增殖和表达tgf-β的作用，说明fs能抑制act介导的肾小管上皮细胞转分化，可能有防治肾组织纤维化的潜能。

【参考文献】
  　　[1] massague j.how cells read tgf-β signals[j].nat rev mol cell biol.2000,1(3):169–178.

　　[2] massague j,blain sw，lo rs.tgf-β signaling in growth control,cancer,and heritable disorders[j].cell.2000,103(2)：295–309.

　　[3] chen yg,lui,hm,lin,sl，et al.regulation of cell proliferation,apoptosis,and carcinogenesis by activin.exp[j].biol.med.2002,227(2)：75–87.

　　[4] maeshima a,zhang yq,nojima y,et al.involvement of the activin-follistatin system in tubular regeneration after renal ischemia in rats.j[j].am.soc.nephrol.2001，12(8):1685-1695.