【摘要】 目的：本研究以构建存活素-增强型绿色荧光蛋白(survivin ＆ egfp)融合基因慢病毒表达载体（p-gcfu-survivin）为例来探讨in-fusion克隆技术在常规载体构建中的应用价值。方法：根据in-fusion技术原理，克隆引物设计时，在survivin同源序列的两侧分别引入经age i线性化的载体p-gcfu两端各15个碱基，将以此引物扩增的聚合酶链式反应（pcr）产物与线性化p-gcfu用in-fusion交换酶在室温下作用30min，使survivin特异性扩增产物两端的序列与线性化载体两端的序列发生同源交换，取2μl交换液进行转化，挑取阳性克隆，进行酶切和测序鉴定。将鉴定正确的阳性克隆瞬时转染293t细胞，观察survivin ＆ egfp融合蛋白在293t细胞中的表达。结果：每2μl克隆交换液获得大约103个克隆数，阳性率达90%以上，瞬时转染p-gcfu-survivin可获得survivin ＆ egfp融合蛋白在293t细胞中的表达。结论：该技术是一种非连接酶依赖性克隆技术，使基因克隆步骤简化并大大节省了实验时间和经费。
【关键词】 基因；克隆细胞；基因，病毒
value of in-fusion cloning techhique on routine vector construction lin chaogui fan lin chen lianglongdepartment of cardiology，union hospital，fujian medical university，fuzhou，fujian，350001， abstract：objective:to introduce a simple method for the cloning of pcr products.methods:the in-fusion cloning technique was described by constructing a recombinant lentivirus vector (pgcfu) with surviving ＆ egfp fusion gene as a sample.the survivin cdna was amplified with survivin genespecific primers with 15 bp extensions homologous to the pgcfu ends.by the action of the in-fusion enzyme at room temperature for 30 minutes，the single-stranded pcr fragment and vector ends were fused due to the 15 bp homology.finally，clones derived from transformation were chosen randomly and identified.results:about 103 positive clones for inserts were obtained after transformation with 2 μl of exchanging products，and the ratio of the positive colonies was more than 90%.after 24 h the p-gcfu-survivin was transfected into 293t eukaryotic cells，the expression of the survivin ＆ egfp fusion gene can be confirmed with fluorescence microscope.conclusion:the ligationindependent property makes the in-fusion pcr cloning technique rapid，reliable and higher cost-effective，avoiding the need for multiple subcloning steps.
key words：genes;clone cells;genes,viral
传统的聚合酶链式反应（pcr）产物克隆技术包括补平末端克隆、ta克隆以及连接酶依赖性克隆等。WWW.11665.coM这些方法的共同特点是在实际操作过程中需要用多种不同的酶（如t4连接酶、磷酸酶等）对pcr产物和/或载体进行处理 [1～3]。虽然大多数情况下使用这些方法能够成功构建目的基因重组载体，但酶切连接过程本身费时费力，并且常常出现克隆失败现象。同时这些方法自身局限性使之难以满足某些特定条件下的基因克隆：（1）酶切位点的选择受到载体和目的基因的双重限制；（2） pcr引物设计时在两端引入酶切位点，由于部分限制性内切酶在酶切过程中需要在识别位点两端留有一定长度的碱基序列，而这些序列可能会显著影响酶切效率，同时由于pcr产物两端的酶切只是减少了几个碱基，酶切成功和完全与否很难用常规电泳检测出来。因此，寻求一种快速、高效、简便的克隆技术对后续基因功能研究极为必要。本研究通过运用in-fusion克隆技术构建存活素-增强型绿色荧光蛋白（survivin ＆ egfp）融合基因慢病毒表达载体，观察其在真核细胞中的表达情况，对in-fusion克隆技术在常规载体构建中的应用进行了初步的探讨。
1 资料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、细胞、质粒：菌株为大肠杆菌dh5a，由福建医科大学感染与肿瘤重点实验室林旭教授惠赠；293t/17细胞购于atcc公司；puc18-survivin质粒（含人survivin全长cdna序列）由美国内布拉斯加州医学中心杨静博士惠赠，并经测序鉴定；p-gcfu（慢病毒表达载体）购于上海吉凯基因化学技术有限公司。
1.1.2 主要分子生物学试剂：胰蛋白胨、酵母提取物购于英国oxoid公司；高保真taq酶和脂质体 2000购于invitrogen公司；dntp购于promega公司；质粒大量抽提试剂盒购于qiagene公司；in-fusion pcr克隆试剂盒购于takara公司；胶回收试剂盒购于stratagene公司；质粒小量抽提试剂盒购于上海中科开瑞公司；胎牛血清、dmem（高糖/低糖）细胞培养基、0.25%胰酶以及左旋谷胺酰氨购于gibco公司；hepes游离酸（高超纯）购于amersco公司。
1.2 方法
1.2.1 引物设计、合成与基因测序：根据in-fusion技术原理，克隆引物设计时，在针对survivin基因序列的上下游引物的外侧分别引入经age i线性化的p-gcfu两端各15个碱基，使克隆引物外侧的15个碱基与线性化载体两端的15个碱基序列同源，其中下游引物去除终止密码的三个碱基，使其与egfp基因形成融合基因。pcr鉴定引物根据survivin和载体设计，其中上游引物位于survivin，下游引物位于载体，且下游引物也用于后续阳性克隆的测序鉴定。引物合成和基因测序均由上海英骏生物技术有限公司完成，具体引物序列与产物片段长度见表1。表1 引物名称及序列（略）
1.2.2 survivin基因cdna的获取：以puc18-survivin质粒为模版，使用高保真taq酶进行survivin基因全长cdna的扩增，上游引物为age i-f，下游引物为age i-r。扩增采用热启动方式，即反应先经预变性5min，待温度上升至80℃后加入聚合酶，随后进入循环，循环条件为94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 45s，共30个循环。
1.2.3 pcr产物回收和p-gcfu慢病毒表达载体的酶切：取10μl pcr扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下将pcr产物的琼脂糖凝胶切下，以胶回收试剂盒回收获得人survivin cdna 溶液，具体步骤按质粒小量抽提试剂盒说明进行。同时，将一定量的p-gcfu以age i限制性内切酶进行酶切，反应条件为37℃ 1 h。酶切产物经过0.75%琼脂糖凝胶电泳后回收，方法同前，并溶于50μl灭菌双蒸水中。
1.2.4 survivin ＆ egfp融合基因重组慢病毒载体（p-gcfu-survivin）的构建：将上述处理过的pcr产物与载体用in-fusion pcr克隆试剂盒将pcr产物与酶切后质粒dna溶液进行交换反应，反应条件为室温30min，制备克隆交换液。
1.2.5 感受态细胞制备及转化：采用cacl2法[4]制备大肠杆菌dh5a感受态细胞。用冷却的无菌吸头取200 μl感受态细胞悬液转移到无菌的微量离心管中，加2 μl 交换液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min；将管放到预加温到42℃热激90秒后快速将管转移到冰浴l～2 min，每管加入800 μl lb培养基；然后将管转移到37℃摇床上振荡培养（250rpm）45min使细菌复苏；将100 μl已转化的感受态细胞均匀涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的 lb固体培养基表面；倒置平皿，于37℃培养16 h；随机挑取若干单菌落置于含100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中，37℃振荡培养过夜（16h）以备后续pcr、酶切和测序鉴定。主要流程见图1。
1.2.6 重组克隆筛选：采用碱裂解法制备质粒dna，具体按试剂盒说明书进行操作。以获取的质粒dna为模版，进行pcr扩增反应，同时设立两个阴性对照，模板分别为等体积的高压灭菌双蒸水和p-gcfu空载体。上游引物为seq-f，下游引物为seq-r，循环条件为94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 45s，共30个循环。取经pcr初步鉴定正确质粒dna 5μl，以age i限制性内切酶于37℃进行酶切反应1 h后，将酶切产物进行0.75%琼脂糖凝胶电泳。再将经酶切鉴定的阳性克隆10μl冻存的菌液，加入3ml含氨苄抗性的lb培养基的试管中剧烈振摇过夜，取1.5ml菌液送上海英骏生物技术有限公司进行基因测序以确保所筛选克隆碱基序列完全正确。
1.2.7 survivin＆egfp融合基因重组慢病毒载体转染293t细胞：细胞于转染前一天以2×105/孔的细胞数接种于24孔培养板，使转染时细胞融合率达到70%～80%；将1μg survivin＆egfp融合基因慢病毒表达质粒与50 μl 无血清培养基混合。取2.5 μl 脂质体2000试剂在另一管中与50 μl 无血清培养基混合后室温孵育5min。把稀释后的融合蛋白质粒与稀释后的脂质体2000轻轻混匀后室温孵育20 min；将此混合液加入培养细胞，将培养板置于37℃ co2培养箱中培养6 h后，换为新鲜培养基（含10%胎牛血清)继续培养。24 h后在相差荧光显微镜下观察survivin＆egfp融合蛋白的表达情况。同时以空载体作为阳性对照、以未转染细胞作为阴性对照。
2 结 果
2.1 survivin基因的亚克隆
通过pcr反应成功获得survivin基因全长cdna（见图2）以及利用age i酶切使p-fugw慢病毒表达载体线性化（见图3）。用2μl交换液转化后获得阳性克隆数约为103个，随机挑取7个克隆进行pcr鉴定，仅一个克隆为假阳性，其余克隆的扩增片段大小与预期大小一致为541bp，而阴性对照经1.5%琼脂糖电泳检测未见扩增条带（见图4）。重复上述实验，克隆数稳定于103的数量级，pcr鉴定阳性率大于90%。随机挑取任一pcr初步鉴定的阳性克隆经age i酶切后，清晰地见到两条条带，大片段约10kb与线性化载体条带位置一致，小片段约为430bp（见图3）。该克隆测序结果与人survivin基因序列完全相符（基因号refnm_001168.2）。
2.2 survivin ＆ egfp融合基因重组慢病毒表达载体直接转染荧光检测
用重组p-gcfu-survivin和对照质粒p-gcfu分别转染293t细胞，24h后相差荧光显微镜检测样品和阳性对照均产生绿色荧光，但前者蛋白定位于细胞浆，而未转染的细胞未观察到绿色荧光（图5，见封三）。
3 讨 论
in-fusion技术是近年来新兴的一种克隆技术，已逐渐应用于基因突变、长片段克隆及多基因融合等研究[5]。berrow等[6]利用这一技术进行高通量载体构建时发现克隆效率超过90%，明显高于gateway重组技术（79%）[7]和经典的限制性酶切连接技术（87%）[8]。运用该技术进行基因克隆时不需要借助连接酶或者磷酸化和补平末端等手段，其技术核心是根据线性化载体两端序列，在pcr引物设计中分别引入15个碱基的载体末端序列，使pcr引物外侧带有的15个碱基序列分别与线性化载体两端相同，然后在反应体系中加入in-fusion交换酶，室温反应30 min，pcr产物即可与线性化载体两端的序列进行定向交换从而使目的基因精确的克隆至目的载体。
本研究应用该技术所构建的survivin＆egfp融合基因重组慢病毒表达载体经过pcr、酶切和测序鉴定证实survivin基因被成功插入到载体启动子之后并与egfp形成survivin＆egfp融合基因，进一步地瞬时转染实验证实了该融合基因能够在293t细胞中正确表达。经重复实验发现使用该方法时2μl交换液转化大肠杆菌感受态细胞可稳定产生约103个克隆、重组效率达90%以上。与传统基因克隆技术相比，in-fusion技术具有独特地优势：（1）无须对pcr产物进行酶切处理，克隆过程中也不需要使用连接酶和磷酸化酶等，简化了实验步骤并节约了实验时间和经费；（2）不受基因序列及载体酶切位点的限制，在质粒载体无合适酶切位点的情况下，将传统克隆技术不可能或难以实现的基因克隆变为可能；（3）在引物设计时无须引入保护性碱基，避免了这些碱基对酶切效率的影响，从而降低了克隆失败的几率。
尽管in-fusion克隆技术具有诸多优点，但目前基因克隆实验中仍多采用传统的基因克隆技术。本研究以构建survivin＆egfp融合基因慢病毒表达载体为例，对in-fusion克隆技术在常规载体构建中应用进行了初步的探讨，结果证实这一技术高效、稳定、便捷，并且可以用于任何载体的基因克隆。更为重要的是，该技术是一种非连接酶依赖性克隆技术，因此如果应用于多基因融合克隆和复杂载体构建，可能为心血管疾病的治疗和机制研究提供有力手段。致谢：感谢福建医科大学感染与肿瘤重点实验室林旭教授悉心的技术指导，感谢美国内布拉斯加州医学中心杨静博士惠赠含全长survivin cdna的puc-18质粒。
【参考文献】
1]marchuk d，drumm m，saulino a，et al. construction of t-vectors，a rapid and general system for direct cloning of unmodified pcr products［j］. nucleic acids res，1991，19(5):1154.
[2]ichihara y，kurosawa y. construction of new t vectors for direct cloning of pcr products［j］. gene，1993，130(1):153-154.
[3]tsang tc，harris dt，akporiaye et，et al. simple method for adapting dna fragments and pcr products to all of the commonly used restriction sites［j］. biotechniques，1996，20(1):51-52.
[4]sabelnikov ag，avdeeva av，ilyashenko. enhanced uptake of donor dna by ca2+ treated escherichia coli cells［j］. mol gen genet，1975，138(4):351-358.
[5]benoit rm，wilhelm rn，schererbecker d,et al. an improved method for fast，robust，and seamless integration of dna fragments into multiple plasmids［j］.protein expr purif,2006,45(1):66-71.
