作者：冯毅翀，徐志伟 ,潘华山 ,赵自明
【摘要】 【目的】观察人参皂苷rg1对运动性疲劳大鼠骨骼肌结构及功能的影响。【方法】选用sd大鼠,随机分为空白组、模型组和人参皂苷rg1组(剂量为50 mg·kg-1·d-1),后2组采用中等强度的跑台运动复制运动性疲劳大鼠模型。在给药后运动造模,连续2周,检测各组大鼠骨骼肌丙二醛(mda)含量、超氧化物歧化酶(sod)活性，线粒体膜电位和游离钙离子含量,并观察各组大鼠骨骼肌超微结构。【结果】模型组大鼠骨骼肌sod活性、线粒体膜电位、游离钙离子含量均降低,mda含量升高,与空白组比较差异均有显著性意义(p<001),骨骼肌细胞及其线粒体、细胞核等结构受损,出现凋亡。人参皂苷rg1组可使大鼠骨骼肌sod活性、线粒体膜电位、游离钙离子含量升高,mda含量降低,与模型组比较差异均有显著性意义(p<001),骨骼肌肌纤维、细胞线粒体和细胞核等超微结构的损伤程度均较模型组减轻。【结论】人参皂苷rg1抗运动性疲劳的作用可能与其能抑制运动所致自由基增加和脂质过氧化诱发骨骼肌细胞损伤有关。
【关键词】 人参皂甙rg1/药理学;运动性疲劳/中药疗法;肌，骨骼/损伤;肌，骨骼/超微结构;疾病模型,动物;大鼠
运动性疲劳是机体进行体育锻炼和运动训练中不可避免的现象,也是限制锻炼和训练效果的重要因素之一[1]。WwW.11665.coM适度的疲劳然后施以合理的恢复手段可以促进人体机能水平的提高,而过度的运动性疲劳和疲劳不及时消除会引起运动疲劳的积累,不仅无助于提高人体的机能水平,而且有可能形成过度训练症候群,最终对健康形成损害[2]。运动性疲劳属于中医“劳倦”和“虚劳”的范畴,具有气虚阳弱的主要病机,而中药人参则具有扶正固本、大补元气和补血生血的功效。本研究拟通过观察人参提取物人参皂苷rg1对运动性疲劳大鼠骨骼肌结构和功能的影响,探讨其抗疲劳的效果和机制。现报道如下。
1材料与方法
11实验动物spf级雄性sd大鼠,体质量180～220 g,由广州中医药大学实验动物中心提供,实验动物使用许可证号：syxk(粤)20080085,使用动物质量合格证明编号：0031686。于广州中医药大学实验动物中心spf级实验室内进行实验,常规分笼喂养,自由饮水进食,动物室内温度21℃～24℃,相对湿度40%～55%,室内空气流通,光照时间12 h。
12药品与试剂人参皂苷rg1(由上海同田生物技术有限公司提供,批号：07120624)临用时用生理盐水按01 ml/kg配成合适浓度后给药,丙二醛(mda)含量、超氧化物歧化酶(sod)活性、钙离子浓度测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。
13主要仪器zhpt动物实验跑台由淮北正华生物仪器设备有限公司提供,jj1型组织研磨机由深圳天南海北公司提供,tdl5a型低速离心机,722分光光度计由上海精密科学仪器公司提供,420型facs流式细胞仪由美国bd公司提供。
14运动疲劳模型的复制[3-4]与分组方法将30只雄性sd大鼠,随机均分为人参皂苷rg1组(rg1组,剂量为50 mg·kg-1·d-1)、模型组(等容积生理盐水)和空白组(等容积生理盐水),每天早上灌胃1 h后将空白组放回笼中常规喂养,人参皂苷rg1组和模型组大鼠则进行中等运动强度的水平跑台运动,速度为15 m/min,坡度0°,跑台20 min,间歇40 min,再跑台20 min,每天1次,连续14 d。所有大鼠每2 d称体质量1次,按照新的体质量确定给药量。
15检测方法
151骨骼肌mda含量和sod活性测定于大鼠左后肢相同部位腓肠肌取2块骨骼肌,约6 g左右, 用4℃生理盐水清洗,滤纸吸干,立即放入清洁干燥密闭小瓶中,-20℃保存备用。分别称取上述冻存骨骼肌组织50 mg,加适量生理盐水,于冰水中用电动匀浆机制备成10 g/l骨骼肌细胞匀浆。骨骼肌mda含量采用硫代巴比妥酸法，sod活性采用黄嘌呤氧化酶法检测,均严格按试剂盒使用说明书进行操作。
152骨骼肌线粒体膜电位测定采用荧光流式仪检测法[5]。取冻存的50 mg左右的同一部位腓肠肌1块,磷酸盐缓冲液(pbs)冲洗,制备成骨骼肌单细胞悬液,300目尼龙网过滤,调样本细胞浓度为1×106/ml,400目尼龙膜过滤以除去细胞团块。取上述骨骼肌细胞悬液加入等体积的rhodamine 123,使其最终浓度为25 μmol/l,37℃避光孵育30 min,pbs洗2次,1 000 r/min离心10 min,采用流式细胞仪(flow cytometry,fcm)对线粒体膜电位进行检测(在2 h内完成),以488 nm激光激发,发射波长为534 nm,每份样本获取106个细胞,cell quest软件分析。线粒体膜电位以阳性百分比(p阳性)表示。
153骨骼肌线粒体游离钙离子含量测定取冻存骨骼肌05 g左右,用眼科剪剪碎后,放入加有生理盐水的10 ml玻璃匀浆器内,于冰水浴中以组织研磨机研磨成100 g/l组织匀浆液。取上述组织匀浆液,离心机4℃、1 000 r/min离心10 min,弃沉淀,取上清液,以4℃、10 000 r/min离心15 min,取沉淀物,于冰水浴中用匀浆机制备线粒体匀浆液备用。采用甲基百里香酚蓝(mtb)比色法,按钙离子测定盒使用说明书进操作。
154骨骼肌超微结构观察于大鼠左后肢相同部位取1块1 mm×1 mm×3 mm大小的腓肠肌,立即投入25 g/l的戊二醛磷酸缓冲液固定,常规10 g/l的锇酸4℃ 后固定、梯度丙酮脱水、环氧树脂815包埋后,制成超薄切片,醋酸铀及硝酸铅染色。在电镜下观察纵切面骨骼肌细胞肌节、肌纤维、肌细胞线粒体、肌细胞核等超微结构的变化。
16统计学方法采用spss 150软件进行统计学分析。采用单因素方差分析,组间均值比较采用snk法,方差不齐时组间均值两两比较采用dunnett t3法。
2结果
21各组对运动性疲劳大鼠骨骼肌sod活性和mda含量的影响由表1可知,模型组与空白组比较骨骼肌sod活性显著降低,mda含量显著升高(均p<001)。与模型组比较,rg1组骨骼肌mda含量显著降低,sod活性显著升高(均p<001)。表1各组对大鼠骨骼肌sod活性和mda含量的影响
22各组对运动性疲劳大鼠骨骼肌线粒体膜电位和线粒体游离钙离子含量的影响由表2可知,模型组与空白组比较骨骼肌线粒体膜电位、游离钙离子含量均显著性降低(p<001)。与模型组比较,rg1组骨骼肌线粒体膜电位、游离钙离子含量均显著性升高(p<001)。表2各组对大鼠骨骼肌线粒体膜电位和游离钙离子含量的影响
23各组对骨骼肌超微结构的影响由图1可知,空白组大鼠骨骼肌纤维肌节清晰可见,肌节长短均一,肌节m线和h线可见,明暗带分界清楚,肌束间肌节排列规则,可见肌束间m线在同一直线上。rg1组和模型组均出现不同程度的肌纤维病变,主要表现为肌纤维溶解、电子密度降低,z线和h线溶解，电子密度降低或消失,明暗带分界不清楚,肌束间肌节排列紊乱等病理改变。其中模型组病变最为明显,典型病变是肌节结构消失,肌纤维中断,z线和h线明显溶解，电子密度降低或消失。由图2可知,模型组和rg1组大鼠骨骼肌线粒体均有不同程度的损伤,表现为线粒体结构与周围组织分界不清,外膜及内膜尚完整,线粒体数较空白组少,且大部分线粒体均可见电子密度明显升高或明显降低,嵴消失明显,嵴上颗粒减少或消失,残存嵴平行排列结构消失或仅见于与线粒体内膜相连处。可见嵴断裂、溶解,排列不规则,线粒体基质电子密度增高者可呈颗粒样变,而低密度病变者少见有内容物。上述病变为以模型组最明显,典型病变是线粒体空泡样变,嵴消失明显,线粒体基质电子密度明显降低,但大多数线粒体膜尚完整。而rg1组出现骨骼肌线粒体肿大、线粒体基质电子密度明显降低、部分嵴消失等。由图3可知,空白组骨骼肌细胞核较大,包在骨骼肌细胞膜内,核膜厚度均匀,核内染色质丰富,染色质电子密度一致,核内染色质未见高电子致密颗粒出现,也未出现高电子密度颗粒与低电子密度核基质，高电子密度边集于核膜,从而出现核膜增厚、电子密度增高等病变。而模型组和人参皂甙rg1组骨骼肌细胞核体积均有不同程度的缩小,核基质密度降低,核内有较多高电子密度颗粒,核膜厚度不均匀,可见高电子密度核膜和较厚的核膜。上述病变以模型组最为明显。
3讨论
运动性疲劳的产生、发展是一个十分复杂的过程,目前学术界还不能用一种假说或理论完全解释疲劳发生的机制。有关运动性疲劳学说主要包括：乳酸堆积说、能源物质耗竭说、物质代谢紊乱说、保护性抑制说和内环境稳定失调说等[6],可发生在神经中枢或外周,各种因素在疲劳发生中都可能起作用,而运动性疲劳的表现既有躯体又有心理。
运动性疲劳在中医中可视为一种比劳动强度更大的剧烈活动引起的劳倦、虚劳等症。特别是当今世界竞技体育运动中的大强度或近极限强度的训练,高强度、大负荷训练加之缺乏运动后恢复导致精气和能量的耗损很大,更易引起过度疲劳或内伤虚劳病。其根本病机为气虚阳弱。
人参始载于《本经》,味甘、苦,性平,入脾、肺、心经,传统中医学认为该药具有扶正固本、大补元气及补脾益肺、生津止渴、安神益智、补气生血等作用,是传统补虚要药。现代研究表明[7]人参含有多种化学成分,主要有人参皂苷、人参多糖、多肽、人参炔醇、麦芽酚、腺嘌呤核苷以及某些氨基酸和微量元素等,其中人参皂苷是人参生理活性最重要的有效成分。因此,本研究选用人参皂苷rg1进行抗疲劳的研究。
长时间有氧运动训练使机体需氧量剧增,但供氧不足,氧化反应使氧自由基产生增加。本实验结果显示中等强度运动2周后骨骼肌细胞线粒体膜电位下降,线粒体内游离钙离子含量下降，骨骼肌组织mda含量增加和sod活性降低,提示中等强度跑台运动可导致骨骼肌功能的损害。而人参皂苷rg1能降低骨骼肌细胞mda含量，增强sod活性,改善骨骼肌细胞内钙稳态失衡和膜电位下降的情况,从而起到抗疲劳的效果。
骨骼肌运动性疲劳的发生、发展均与骨骼肌细胞的结构、功能的变化直接相关。运动疲劳后出现肝细胞、肌细胞线粒体膜流动性降低,线粒体游离钙先升高后降低、总钙持续增加,线粒体膜电位持续降低发生细胞凋亡与骨骼肌纤维结构的改变[8-12]。本实验结果显示中等强度运动2周后肌节结构消失、肌纤维中断,z线和h线明显溶解、电子密度降低或消失,虽然大多数线粒体膜尚完整,但线粒体空泡样变、嵴消失明显，线粒体基质电子密度明显降低,核染色质浓缩边集，核缩小，核膜增厚,表现为细胞呈凋亡病理形态,提示中等强度跑台运动可导致骨骼肌细胞及其线粒体、细胞核等结构受损而出现凋亡。人参皂苷rg1组和模型组比较,其骨骼肌肌纤维、骨骼肌细胞线粒体和细胞核等超微结构的损伤程度较轻,提示人参皂苷rg1能有效拮抗运动性疲劳后的骨骼肌损伤,达到抗疲劳的效果。
综上所述,人参皂苷rg1具有抗运动性疲劳的作用,其机制可能与抑制运动所致自由基增加和脂质过氧化诱发骨骼肌细胞损伤有关,其确切机制有待进一步研究。
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