【摘要】 目的 探讨紫花茄皂苷i1对人肝癌bel7402细胞的抗肿瘤作用并对其进行溶血性检查。方法 用酸性磷酸酶（apa）法测定不同浓度紫花茄皂苷处理人肝癌bel7402细胞后的od405值。体外溶血性实验检测皂苷安全性。结果 紫花茄皂苷对bel7402细胞有明显的抗肿瘤作用，在皂苷作用72 h后，实验组与对照组的od405值比较差异有显著性（p＜0.05）。体外溶血实验，100 μg·ml-1的皂苷ⅰ1不引起兔红细胞的溶血和凝集。结论 紫花茄皂苷i1对人肝癌细胞的抗肿瘤作用呈明显的浓度依赖性,在体外安全性较好。
【关键词】 皂苷 抗肿瘤 溶血
【abstract】 objective to investigate the antineoplastic activity and blood cell haemolysis test on saponin. methods the od405 value of cell was detected after saponin treatment by the acid phosphatase assay (apa). the safety of saponin was examined by haemolysis and blood cell agglutination tests.results the saponin significantly inhibited proliferation of bel7402 cells. apparent difference in od405 value was detected after bel7402 cells had been exposed to the saponin for 72 hours compared with control group（p＜0.05）. it was proved that 100μg·ml-1 saponin caused no haemolysis and blood cell agglutination in vitro.conclusion the saponin i1 has concentrationdependent antineoplastic activity on human hepatocarcinoma cells. the safety of saponin was better in vitro.
【key words】 saponin,antineoplastic, haemolysis
皂苷是广泛存在于高等植物和某些低等动物中的一类具有广泛药理活性的三萜及甾体的糖缀合物，很多中草药的主要活性成分都是皂苷类化合物。wwW.11665.COm近年来随着分离提取技术的不断发展，多种薯蓣皂苷被分离出来，并不断发现其新的生物活性，特别是在抗肿瘤、免疫调节、干预细胞信号转导、抗炎、降血脂、抗艾滋病等方面的作用引起了人们的重视［１，２］。紫花茄皂苷是根据从紫花茄中分离出的甾体皂苷化学合成的薯蓣皂苷［３］，具有较强的抗肿瘤活性。我们的研究表明紫花茄皂苷可以诱导肝癌细胞凋亡［4］，在肝病用药中很有前途。本研究对紫花茄皂苷进行体外抗肿瘤及溶血性实验，结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器 rpmi1640培养基购自gibco brl公司。dhanks 液，pbs缓冲液，0.1%edta溶液等均按常规配制［5，6］，新生牛血清（黑龙江省同江市江海生物公司），二氧化碳培养箱（hereus公司)，96孔细胞培养板（nunc公司），el311酶标免疫检测仪（biotek公司），相差倒置显微镜（olympus）。
1.2 实验动物 新西兰大白兔，雄性，体重2.5 kg，由滨州医学院实验动物中心提供。
1.3 药物及配制 紫花茄皂苷i1由中国科学院生态研究环境中心生物技术室提供。以二甲基亚砜（dmso）溶解后用生理盐水稀释至100 μg/ml，其中dmso浓度为0.1％。
1.4 2%红细胞悬液的制备 取10 ml新鲜新西兰兔血，滴入含2500 iu肝素钠的离心管中，加入10 ml生理盐水，摇匀后2 500 r/min离心5 min，倾去上清液，再加生理盐水混合离心，反复洗4 次，最后一遍用巴比妥钠缓冲液洗至上清液呈无色透明，然后将所得红细胞用巴比妥钠缓冲液稀释成红细胞压积百分比为2%的红血细胞混悬液。
1.5 酸性磷酸酶法（acid phosphatase assay, apa）［7］检测细胞存活率 取对数生长期细胞，消化后制成细胞悬液，按1×103/孔的密度接种于96孔板。培养24 h后，实验组加入先用二甲基亚砜（dmso）溶解、再经rpmi1640培养液稀释至终浓度为1～10 μg·ml-1的皂苷；空白对照组加入rpmi1640培养液；溶剂对照组加入经同样稀释的溶剂，含0.01%～0.1%dmso。实验中每个浓度设8个平行孔，作用72 h后用apa法经el311酶联免疫检测仪在405 nm波长处测定吸光度od值，空白孔调零，实验重复三次，取平均值。
1.6 溶血性实验［8，9］ 在2 %的兔红血细胞混悬液中，分别加入不同体积的100 μg·ml-1的皂苷ⅰ1，轻轻摇匀置37℃水浴中保温1 h后，2000 r/min离心5 min，每管取上清100 μl，经el311酶联免疫检测仪于波长405 nm测量吸光度。第6组不加皂苷, 作为空白阴性对照；第7组不加皂苷并用蒸馏水代替巴比妥钠缓冲液，作为充分溶血阳性对照（表1）。空白组调零，每组设3个平行孔，计算吸光度平均值。实验重复三次，取平均值。
根据吸光度平均值按下式计算相对溶血率：
相对溶血率＝od实验组/ od阳性对照×100％。 表1 各实验组配比量表
1.7 统计学方法 所得数据以均数±标准差表示，采用spss 10.0统计分析软件包分析统计学差异。
2 结果
2.1 紫花茄皂苷的体外抗肿瘤作用 不同浓度的紫花茄皂苷i1作用于bel7402细胞72 h后,apa法测定结果如表2, 实验表明，加药组从2.0 μg·ml-1起，与对照组的od405比较，即有显著性差异(p＜0.05),而且随着皂苷浓度的增加抗肿瘤作用也增加, 呈剂量依赖性。 表2 紫花茄皂苷i1对bel7402细胞抗肿瘤作用 注：与空白对照比较, *p＜0.05,△p＜0.001
2.2 溶血性试验评价 实验结果见表3，不同体积的100 μg·ml-1的皂苷ⅰ1作用于新鲜兔血后，根据公式计算出1、2、3组的溶血率均小于5%，表明100 μg·ml-1的皂苷ⅰ1体外溶血实验，不引起红细胞的明显凝集和溶血，安全性较好。
3 讨论
恶性肿瘤或癌症是目前威胁人类生命和健康的严重疾病之一，与心血管病、糖尿病并称为现代社会的三大杀手，给人类的身心健康带来巨大的损害。寻找有效的抗肿瘤方法具有强烈的社会需求，是多年来世界各国学者面临的重大课题，并已取得大量成果。但目前一个重要的问题是，大部分治疗肿瘤的方法给患者，尤其是晚期患者带来的创伤过大。表3 皂苷ⅰ1的溶血实验无论是手术还是放、化疗，其痛苦和代价有时不呰于肿瘤本身。大量研究结果表明，植物来源的抗肿瘤药具有种类多、毒副作用小、不良反应少的特点。因此，从植物中寻找高效的抗肿瘤药物已成为一种新的研究思路。
本文利用apa法，以抑制肿瘤细胞增殖为活性指标，对紫花茄皂苷进行活性筛选，确定出一些有较好生物活性和稳定性，具有深入研究价值的结构，对其进行深入研究。本实验观察了不同剂量的紫花茄皂苷i1对人肝癌bel7402细胞的抗肿瘤作用。将bel7402细胞与不同浓度的紫花茄皂苷共同孵育72h后测定各组吸光度值,结果表明紫花茄皂苷i1能明显抑制体外培养的bel7402细胞的生长(p＜0.05), 并呈浓度依赖性。提示皂苷i1对bel7402细胞具有明显的体外抗肿瘤作用。
采用《中国药典 》2005版中药安全性检查法应用指导原则“溶血与凝聚检查法”，参照国家食品药品监督管理局制定《化学药物刺激性、过敏性和溶 血性研究技术指导原则 》相关内容进行皂苷的体外安全性评价。体外溶血实验显示皂苷不引起兔红血细胞的溶血与凝集，安全性较好，有望成为临床上的抗癌新药。
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