【摘要】 【目的】测定甘草次酸(ga)脂质体的包封率，并考察其体外释放规律。【方法】采用注入法制备甘草次酸脂质体，用葡聚糖凝胶g50柱分离ga脂质体和游离ga，高效液相色谱(hplc)法测定包封率。按照中国药典(2005年版)溶出度第3法考察甘草次酸脂质体体外释放规律。【结果】测得甘草次酸脂质体平均包封率为9161%，甘草次酸脂质体的体外释放曲线符合higuchi方程。【结论】甘草次酸脂质体具有较高的包封率，在体外具有良好的缓释作用。
【关键词】 甘草次酸/生产和制备;脂质体;体外释放;包封率;色谱法，高压液相
甘草次酸(glycyrrhetinic acid，ga)为中药甘草的主要有效成分，主要从甘草的根部或根茎提取而得，属五环三萜皂苷类化合物。已知甘草次酸具有明显的抗炎、抗病毒、抗肿瘤和防癌作用[1-2]，临床上常用来治疗慢性肝炎及肝癌。由于ga难溶于水，口服几乎不吸收，普通注射剂的生物利用度低，通过脂质体制备技术将ga包裹于磷脂双分子层中，可以增加难溶性药物的水溶性，改变被包封药物的体内分布使其具有一定的靶向性[3]，提高药物与肿瘤细胞的亲和性。本研究制备了ga脂质体，并对其包封率和体外释放度进行了考察，现报道如下。
1主要仪器与试剂
主要仪器如下：jem1400 高衬度透射电子显微镜(日本电子公司)，zetasizer 1000ha粒度仪(英国malvern公司)，zetasizer激光粒度测定仪(英国malvern公司)，901型恒温磁力搅拌器(上海沪西分析仪器厂)，dionex高效液相色谱仪(hplc，p680型泵，pda100型检测器，asi100自动进样器，美国戴安公司)，spectrum透析袋(mwco：12000～14000，上海百赛生物技术有限公司)，sartorius bs110s电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)。WWw.11665.cOM主要药品和试剂如下：18βga(甘肃兰特植物化学有限公司)，ga对照品(中国药品生物制品检定所，批号：7239203)，注射用蛋黄卵磷脂(德国lipoid公司)，胆固醇(天津市博迪化工有限公司)，十八胺(sigma公司)，sephadex g50(瑞典pharmacia公司)，甲醇为色谱纯，其他药品、试剂均为国产分析纯。
2方法与结果
21ga脂质体的制备
采用注入法[4]制备ga脂质体。定量称取磷脂、胆固醇、ga及十八胺溶于适量的无水乙醇中，将所得类脂溶液缓慢匀速地注入到恒温55℃的磷酸盐缓冲液(pbs，ph74)中，注入过程中通入n2以除去乙醇。注入完毕后，45℃孵育20min后，依次经08、045、02μm的微孔滤膜即得ga脂质体。
22脂质体的形态、粒径和zeta电位测定
ga脂质体供试品适当稀释后，用质量分数1% 的磷钨酸负染，于透射电镜下观察其形态并照相。另取ga脂质体供试品经适当稀释，用激光粒径分析仪分别测定脂质体的平均粒径和zeta电位，结果见图1～图3。测得3批供试品的平均粒径为(141±10)nm(n=3)，平均zeta电位为(359±5) mv (n=3)。
23包封率和体外释放测定方法[5]
231色谱条件固定相luna c18 色谱柱(250mm×46mm，5μm，phenomenex)，流动相为甲醇—水—冰醋酸(体积比89∶10∶1)[6]，流速为10ml/min，检测波长为250nm，柱温为30℃，进样量为20μl。
232色谱图的制备分别取处方量配比的空白脂质体，ga对照品和ga脂质体用适量甲醇溶解后按上述色谱条件进样测定，并记录色谱图，结果见图4。由结果可见，脂质体辅料对ga含量测定无干扰。
t/mint/mint/min
a.ga对照品b.ga脂质体c.空白脂质体
图4高效液相色谱图
figure 4hplc chromatograms of ga liposomes
233方法学考察精密称定ga对照品101mg于100ml 量瓶中。甲醇溶解定容至刻度得ga储备液。精密吸取上述储备液05、10、50、100、200、400ml 分别于50ml 量瓶中，甲醇定容，得101、202、1010、2020、4040、8080mg/l 的溶液。按231项下色谱条件，取不同浓度溶液分别进样，记录峰面积。以峰面积(a)对对照品浓度(c)回归。在101～8080mg/l范围内，呈良好线性关系。回归方程：a=09256c-09890，r=09996。
按处方的配比制备空白脂质体，加入含处方量ga对照品溶液的容量瓶中，以无水甲醇破乳，并稀释定容，使药物浓度分别为101、1020、8080mg/l，按2.3.1项下色谱条件进样测定峰面积并计算回收率。同法制备上述溶液，于日内及日间测定峰面积并计算药物含量考察方法的精密度。结果显示：低、中、高浓度的方法回收率分别为(10013±032)%、(9923±034)%、(10124±012)%;低、中、高浓度的日内sr分别为058%、062%、035%，日间sr分别为071%、075%、061%。
24包封率测定
241ga脂质体与游离药物的分离采用葡聚糖凝胶g50柱分离ga脂质体与游离的ga。精密量取ga脂质体02ml上柱(直径13mm，柱床高25cm)，注射用水洗脱，流速1ml /min 。收集洗脱液，每份2ml共40份。将洗脱液分别过微孔滤膜后按231项下色谱条件进样测定峰面积。以洗脱体积为横坐标，峰面积为纵坐标绘制流出曲线。图5结果表明：ga脂质体通过凝胶柱后，脂质体和ga游离药物被分离。
图5ga脂质体葡聚糖凝胶g50流出曲线
figure 5elution curve of ga liposomes
seperated by sephadex gel g50
242葡聚糖凝胶g50柱加样回收率实验配制低、中、高3个不同浓度的ga标准溶液，分别与空白脂质体混和，得标准混和液，移取02ml上柱，按照洗脱曲线，收集游离ga，进行hplc测定，计算柱的加样回收率。结果显示ga低、中、高3个加入量的加样回收率分别为(9861±043)%、(9953±052)%、(9926±036)%。
243包封率的测定精密量取ga脂质体02ml，加样于sephadex g50柱，以注射用水为洗脱液分离游离药物。弃去前25ml洗脱液，收集游离药物部分50ml，蒸干，残渣用流动相溶解定容至10ml，微孔滤膜过滤后取20μl进样测定，代入标准曲线计算未被脂质体包封的游离甘草次酸浓度cu。另取02ml置10ml量瓶中，加入适量甲醇充分振摇破乳，用流动相定容，微孔滤膜过滤后取20μl进样测定，代入标准曲线计算总的甘草次酸浓度ct。根据公式计算脂质体的包封率：p包封=(1-cu/ct)×100%。测定3批脂质体的包封率分别为9062%、9131% 和9289%，平均包封率为9161%。
25体外释放度测定
251药物释放的回收率配制药物溶液约5mg/ml，精密移取3ml入透析袋，两端扎牢，置于500mlph90的硼酸盐溶液中，磁力搅拌。一段时间后，取点测得峰面积a1。另取药物溶液3ml直接稀释同样的倍数，测得峰面积a2。按公式p= a1/a2×100%计算药物释放的回收率为(9924±085)%，符合释放要求。
252累积释放量曲线的测定精密移取ga原料药溶液、ga脂质体混悬液各30ml分别装于经预处理的透析袋内，两端扎牢，绑于溶出仪的搅拌桨上。按照中国药典[7]溶出度第3法测定释放度。释放条件：ph90的硼酸盐溶液500ml(脱气)、(37±05)℃、100r/min。定时取样3ml，并及时补充等温的同体积空白介质。微孔滤膜过滤后hplc 法测定含量(mt)。按公式p累积释放(%) =mt/m0×100% 计算释放量。其中m0 为ga脂质体混悬液中ga的含量，不同时间的药物累积释放量见图6。
图6结果表明，脂质体中药物的释放有明显的缓释效果。脂质体制剂在前10h的累积释放量为30%左右，在72h内可基本保持稳定且呈现一定缓释作用，而作为对比的ga溶液在10h就几乎释放完全。
253释放方程拟合以ga脂质体在ph90的硼酸盐溶液中的释放相为研究对象，分别通过零级动力学方程、一级动力学方程，higuchi方程和weibull方程对体外释放曲线进行拟合，结果见表1(其中q为累积释放量，t为释药时间)。从拟合结果看，脂质体中药物的释放最符合higuchi方程，γ=09961。表1ga脂质体释放曲线的方程拟合(n=3)
3讨论
本研究采用乙醇注入法，制备过程中通入n2除去乙醇，在乙醇挥发的同时脂质分散进入水相形成脂质体。该法制得的脂质体粒径适宜，工艺简单可行[4]。
实验中采用葡聚糖凝胶柱层析法分离含药脂质体和游离药物。中国药典(2005年版)规定，含药脂质体与游离药物的分离可使用凝胶柱色谱法、离心法或透析法。但离心法对仪器的要求较高，且含药脂质体在高速转动下可能存在导致药物渗漏的可能。透析法虽操作简单，但耗时较长。ga是一种小分子化合物，其相对分子量为47064，脂质体的相对分子质量在1×105～3×105万，利用sephadex g50柱分离脂质体与游离药物效果很好。由洗脱曲线可见，游离药物与含药脂质体不但分离效果好，而且简单快速。通过柱加样回收率实验，显示了该方法能准确测定游离药物的量。
ga是脂溶性药物，在ph74的缓冲液中溶解度极小，因此在选择透析介质时使用了较高ph值的硼酸盐溶液[8-9]。在实验中发现，硼酸盐溶液能将一个处方量的ga完全溶解，且在平衡时间内不会造成脂质体的渗漏，故选择硼酸盐溶液为平衡透析介质。
ga脂质体在体外释放缓慢，释放规律最符合higuchi方程。结合包封率数据，说明用本法制得的脂质体大部分药物是以分子或细小粒子形式包裹在磷脂双层膜中，主要以扩散的形式实现药物缓慢释放。
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