作者：杨瑞仪,杨雪芹,冯丽玲
【摘要】 【目的】 研究青蒿素生物合成基因在不同发育时期和不同组织中的表达规律,探讨青蒿素生物合成的时空调节机制。【方法】 利用实时荧光定量pcr技术定量追踪分析青蒿素主要及协同合成途径基因在盛叶期、开花前、开花后不同的发育时期,以及在根、茎、叶、花不同组织中的表达模式。【结果】 各基因的表达水平在6月份时最低,随后开始上升,在8月份(开花前)达到高峰,与6月份比较，转录水平显著提高3~15倍(均p<001),其中青蒿素特异合成酶基因ads和cyp71av1上升幅度最大,为最低水平的12和15倍,9月份(开花后)则呈下降趋势。处于盛花期的青蒿在根、茎、叶、花各个组织中都能检测到青蒿素合成基因的表达,叶片中ads基因mrna水平较其他组织显著升高2倍左右(均p<001),显示组织表达特异性。【结论】青蒿素生物合成基因的发育表达模式与青蒿素的合成规律一致。ads和cyp71av1基因的表达在青蒿素生物合成过程中可能起关键作用。
【关键词】 青蒿素/生物合成;基因转录;基因表达
青蒿素是1970年代由我国科学家根据古籍记载及民间验方首先从中药青蒿(artemisia annua l.)中发现并率先应用的抗疟药,疟原虫至今尚未对其产生抗药性,为who所推荐使用的一线疟疾治疗药物。www.11665.CoM在青蒿中,青蒿素的生物合成以萜类化合物共同前体——异戊烯基焦磷酸(ipp)为前体。ipp在法呢基焦磷酸合酶(fps)的作用下生成法呢基焦磷酸(fpp),fpp经青蒿所特有的紫穗槐二烯合酶(ads)环化生成紫穗槐-4,11-二烯 [1],然后细胞色素p450单加氧酶(cyp71av1)催化紫穗槐-4,11-二烯经青蒿醇、青蒿醛生成青蒿酸[2-3]。其中青蒿醛可经青蒿醛δ11(13)双键还原酶(dbr2)催化生成双氢青蒿醛,后者再由cyp71av1氧化生成双氢青蒿酸[4]。以上步骤已经经过实验证实,但从青蒿酸或/和双氢青蒿酸到青蒿素的过程仍停留在假说推演阶段。植物中存在着2条ipp合成途径[5],即细胞质中经典的甲羟戊酸(mva)途径和质体中的脱氧木酮糖-5-磷酸(dxp)途径。在许多植物中,这2条位于不同亚细胞空间的萜类合成途径并不是孤立的,而是存在协同效应[6-8]。towler等[9]发现在青蒿素生物合成中也存在类似的现象：青蒿可以利用2条途径的ipp来合成青蒿素,其中mva途径为青蒿素主要合成途径,dxp途径为协同合成途径。
尽管青蒿素化学全合成的技术问题早在1980年代就由我国科学家许杏祥等解决,但其合成路线繁琐,工艺复杂,成本高,不适合工业化生产。而利用微生物发酵生产青蒿素的研究至今仅培育出产青蒿素前体青蒿酸的酵母工程菌。目前,从青蒿中提取青蒿素仍然是青蒿素商品化生产的唯一方式,因此通过代谢途径工程来提高青蒿的青蒿素合成量就成为最有前景的可行方法。然而,至今关于青蒿素合成机理尤其是青蒿素合成基因表达调控的研究仍然是青蒿素生物合成研究的薄弱环节,这大大延缓了青蒿素代谢途径工程的研究进展。本实验采用实时荧光定量pcr技术(rtfqpcr)分析了青蒿素合成基因在不同的发育阶段及组织中的表达规律,初步揭示了青蒿素合成基因表达的发育及组织特异调节机制,为进一步开展青蒿素高产代谢基因工程改良提供科学依据。现报道如下。
1材料与方法
11植物及样品采集青蒿(a. annua)种子(四川酉阳,华阳2号)3月下旬撒播在广州中医药大学药圃内。分别在青蒿盛叶期(6月和7月)、开花前(8月)及开花后(9月)中旬采集青蒿植株中部叶片,并在9月中旬开花后分别采集青蒿植株根、茎、叶及花作为样品(n=6)。所有样品均在液氮中保存备用。
杨瑞仪等.青蒿素生物合成基因的转录谱分析第4期2010年第27卷广州中医药大学学报12主要试剂与仪器质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、rnaprep pure植物总rna提取试剂盒均为tiangen公司产品,revertaidtm h minus first strand cdna synthesis kit为fermentas公司产品,sybr green realtime pcr master mix为toyobo公司产品。spxbg型光照培养箱购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂,ultrospec 3300 pro 紫外可见光分光光度计产自美国ge公司,定量pcr反应在美国应用生物系统公司abi7300实时荧光定量pcr仪上进行。
13定量pcr标准样品的建立青蒿素生物合成各相关基因的质粒——pmd18hmgr、pmd18fps、 pet29aads、pmd18cyp71av1、pmd18cpr、pmd20dbr2、pmd18dxs、pmd18dxr以及内参基因actin的质粒——pmd20actin均由本实验室构建。用相应的限制性内切酶将各质粒消化成线性dna(pmd18hmgr∶hindⅲ;pmd18fps、 pet29aads、pmd18cyp71av1、pmd18cpr∶bamhⅰ;pmd20dbr2、pmd18dxs、pmd18dxr、pmd20actin∶ecorⅰ),回收纯化测定浓度后,按照公式：ncopies=浓度/分子量×6023×1023将各线性化的标准样品稀释成107、106、105、104、103、102 copies/μl。定量pcr时加入25μl梯度稀释的相应基因的标准样品绘制标准曲线。
14总rna提取及第一链cdna合成取青蒿样品100mg,按照rnaprep pure植物总rna提取试剂盒说明书提取总rna。取1μg 总rna,按照revertaidtm h minus first strand cdna synthesis kit说明书进行逆转录反应,合成cdna。
15基因表达的rtfqpcr检测根据相应的青蒿基因序列,用primer 30在线软件程序(http:// frodo.wi.mit.edu/)设计各基因定量pcr引物(表1),引物由invitrogen公司合成。以actin基因为内参。实时荧光定量pcr反应液配制按sybr green realtime pcr master mix说明书进行：125μl sybr green realtime pcr master mix、1μl引物对(两条引物各10μmol/l)、9μl灭菌三蒸水、25μl10倍稀释的cdna样品,总体积为25μl。定量pcr反应循环条件为：95℃、60s，95℃、15s,60℃、15s,72℃、45s(信号收集),40个循环。熔解曲线分析步骤为：95℃、15s,60℃、30s,95℃、15s。每个样品设3个平行,求出平均值,基因的相对转录水平以基因mrna copies/actin mrna copies表示。
16统计学方法采用spss115软件进行数据统计,用单因素方差分析(oneway anova)进行统计学显著性分析。表1定量pcr引物
2结果
21青蒿素生物合成主要基因在不同发育时期的转录特性
青蒿素生物主要合成途径(mva途径)的关键酶基因包括ipp合成上游的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因(hmgr)以及下游的fps、ads、cyp71av1、cpr、dbr-2基因。采用rtfq-pcr方法检测了上述基因在青蒿盛叶期(6、7月)、临近开花前(8月)和开花后(9月)的转录模式,得到各基因的标准曲线方程及决定系数分别为：actin∶y=-3393095x+41201069,r2=0997841;hmgr∶y=-3476657x+39523457,r2=0997848;fps∶y=-3389733x+35215302,r2=0997412;ads∶y=-3224546x+38216091,r2=0998369;cyp71av1∶y=-3476058x+38277225,r2=0996758;cpr∶y=-3476720x+38277225,r2=0998181;dbr2∶y=-3847960x+44088917,r2=0998057。图1结果显示,hmgr、fps、cyp71av1的表达水平较低(相对转录水平为002～02);ads与cpr的表达属于中等水平(相对转录水平为02～30);dbr-2的表达水平较高(相对转录水平为30～100),为低水平表达组基因的10～100倍。
各基因的表达水平在6月份时最低,随后开始上升：其中hmgr、fps、ads、cyp71av1、cpr的转录水平在开花前(8月)达到高峰后,开花后(9月)则呈下降趋势(图1-a、b);dbr-2基因的转录水平到9月仍呈上升趋势(图1-b)。与转录水平最低的6月比较,各基因在转录高峰时的转录水平显著提高3～15倍(均p<001),其中青蒿素特异合成的关键酶基因ads和cyp71av1上升幅度最大,为最低水平的12和15倍。
统计方法：单因素方差分析;①p<001,与6月份转录水平比较
图1青蒿素生物合成主要基因在不同发育时期的转录水平
figure 1developmental expression patterns of artemisinin biosynthetic genes
22青蒿素生物合成协同途径相关基因在不同发育时期的转录特性
青蒿素生物合成同时也能利用质体dxp途径合成的ipp作为前体。因此,本文也同时采用rtfq-pcr方法检测了dxp途径中ipp合成的关键酶基因——dxs和dxr在青蒿青蒿不同发育阶段的表达模式,得到各基因的标准曲线方程及决定系数分别为：actin∶y=-3393095x+41201069,r2=0997841;dxs∶y=-3651419x+40314491,r2=0991474;dxr∶y=-3528084x+36050751,r2=0993824。图2结果显示,在不同的发育阶段, dxs和dxr的表达规律与青蒿素主要合成途径基因的发育表达模式基本一致。相应的mrna水平在6月份相对较低,7月后迅速提高,与6月份水平比较，8月基因表达水平显著升高5~6倍(均p<001),9月开花后开始回落。结果间接表明细胞质mva途径及质体dxp途径可能共同参与青蒿素的生物合成。
统计方法：单因素方差分析;①p<001,与6月份转录水平比较
图2青蒿素生物合成协同途径相关基因在不同发育时期的转录水平
figure 2developmental expression patterns of artemisinin biosynthetic genes on the cooperative pathway
23青蒿素生物合成基因的组织特异性转录
图3结果显示,在9月青蒿开花后采集根、茎、叶、花等组织检测青蒿素合成主要及协同途径的基因表达,发现处于盛花期的青蒿在根、茎、叶、花各个组织中都能检测到hmgr、fps、ads、cyp71av1、cpr、dbr-2、dxs和dxr基因的表达。其中,hmgr、fps、cyp71av1、cpr、dbr-2、dxs和dxr基因在各组织的表达水平无显著差异,表明这些青蒿素合成基因的表达在转录水平无明显的组织特异性。但中水平表达组叶片中ads基因mrna水平较其他组织的水平显著升高2倍左右(均p<001),显示组织表达特异性。rtfq-pcr各基因的标准曲线方程及决定系数分别为：actin∶y=-3939095x+41201069,r2=0997841;hmgr∶y=-3344985x+38589870,r2=0996925;fps∶y=-3393294x+35677765,r2=0996712;ads∶y=-3378548x+39118320,r2=0996767;cyp71av1∶y=-3457978x+37969635,r2=0997332;cpr∶y=-3479555x+38889797,r2=0999238;dbr-2∶y=-3873987x+44862797,r2=0997820;dxs∶y=-3587049x+40033127,r2=0990662;dxr∶y=-3572425x+39707245,r2=0994868。
统计方法：单因素方差分析;①p<001,与根、茎、花的转录水平比较
图3青蒿素生物合成基因在不同组织的转录水平
figure 3transcriptional expressions of artemisinin biosynthetic genes in different tissues
3讨论
青蒿素的含量与植株的生长发育直接相关,通常认为在开花前[10]或正在开花时[11-12]的青蒿素含量最高。也有研究表明,在青蒿叶内,青蒿素约从4月份叶片刚出现时渐渐开始合成和积累,在5、6月份开始升高,在8、9月达到顶峰。本课题组追踪采集了从6月份到9月份(开花)的青蒿叶片,检测了青蒿素合成基因的mrna水平,发现各基因在6月份的mrna水平最低,在7月后迅速提高,到8月份(临近开花前)基因的mrna水平达到顶峰,9月(开花后)基因的表达水平开始回落。由此看来,青蒿素生物合成基因的转录与青蒿素的合成规律一致,表明青蒿素合成基因的表达直接影响青蒿素的合成。同时还发现青蒿质体dxp途径基因(dxs和dxr)与细胞质mva途径青蒿素主要合成基因的发育表达模式基本一致,间接表明质体dxp途径可能协同参与青蒿素的生物合成。
dbr-2基因与其他基因的表达模式不同,在9月份其他基因表达量开始下降时,其表达水平仍呈现上升势头。dbr2基因编码的青蒿醛δ11(13)双键还原酶作用于青蒿素生物合成途径的下游,负责催化青蒿醛生成双氢青蒿醛,双氢青蒿醛再由cyp71av1基因编码的细胞色素p450单加氧酶氧化成双氢青蒿酸,再进一步转化为青蒿素[4]。由此可以推测,在前一阶段,由于青蒿素合成途径中较上游的基因持续高水平表达,导致青蒿素合成前体(如青蒿醛)的积累,可能需要青蒿醛δ11(13)双键还原酶持续维持高表达水平来促进青蒿醛的进一步转化,以促进青蒿素在开花期的合成与积累。
青蒿素的积累具有组织特异性,在花和叶片的腺毛中含量最高[13-14],茎次之,根系中含量最少。在青蒿营养期,90%的青蒿素聚集在叶和优质茎中;正在开花的植株中,叶中的青蒿素含量约占总量的30%,冠状花序中约含40%的青蒿素;根中所含青蒿素在整个生长过程中都较低[13]。本课题组对青蒿根、茎、叶、花等组织中青蒿素生物合成的相关基因mrna水平的定量检测结果显示,hmgr、fps、cyp71av1、cpr、dbr-2、dxs和dxr基因在青蒿各组织中都有表达,且表达量无明显差异,但青蒿素合成关键酶基因ads在叶片中的表达水平明显高于其他组织。在青蒿萜类化合物合成中,fpp是多种萜类物质的共同前体,可在不同的酶的催化作用下进一步生成不同的萜类物质。紫穗槐二烯合酶(ads)是青蒿所特有的倍半萜合酶,它催化fpp生成紫穗槐二烯,是青蒿素生物合成分支途径的第一个限速酶[1]。wallaart等[15]曾报道青蒿试管苗只有经过干旱(30%相对湿度)和强光(6000lx)处理后才能扩增到ads编码基因,提示ads可能是一个诱导基因。本课题组在过往的研究中也进一步证实ads的表达具有诱导特性,且其表达量与青蒿素产量密切相关：经过低温(4℃)处理青蒿试管苗ads的表达提高11倍,青蒿素含量上升66~95%[16]。而且,本课题组从青蒿基因组中成功克隆了ads基因的启动子(adsp),并在烟草中建立了adsp调控表达的β-葡萄糖苷酸酶(gus)检测平台,发现在低温和紫外辐射条件下,gus活性显著提高,表明adsp序列中存在诱导表达的作用元件[17]。在本研究中发现在开花前ads基因mrna水平上升11倍,且在叶片组织中也呈现高水平,用elisa法检测该基因编码的ads在根、茎、叶中的含量,结果显示ads 在叶中的含量分别比根、茎高16和10倍 [18]。上述结果表明,ads 基因表达受到发育和环境胁迫的双重调控,且具有组织特异性,可能是青蒿素合成的关键调控点。将反义鲨烯合酶基因(assqs)导入青蒿基因组中,建立了高产青蒿素的转assqs基因青蒿株,伴随sqs表达量的下降,ads表达水平上升11~34倍,在此基础上进一步通过低温诱导使ads mrna水平再提高2~5倍,青蒿素产量从原来的671 mg/g干重提高到最高达166 mg/g干质量[17,19]。另外,在本研究中cyp71av1基因的表达量在发育过程中也显著提升,提示该基因可能成为青蒿素合成代谢途径中的另一个关键调控点。
(致谢：本实验室尹录录为本研究提供了pmd18-cyp71av1、pmd18-cpr质粒,在此谨表示诚挚的谢意。曾庆平、陈沛泉、曾晓梅、卢文婕、曾丽香、郭晓霞也为本研究提供了有益的帮助,在此一并致谢)
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