【摘要】  目的 优选桂枝甘草汤方药成分提取时药材的最佳组合方式。方法 将方药分成混煎组和桂枝、甘草单煎混合组,用半仿生提取法提取,提取液作甘草次酸、肉桂酸、总黄酮、挥发油、干浸膏的含量测定及50%乙醇精制液的hplc指纹图谱比较。结果 除干浸膏2种组合提取液含量相近外,其余4个指标成分含量混煎液均明显高于单煎混合液；2种组合提取液的hplc指纹图谱无明显差异；hplc梯度洗脱总积分面积及主要特征峰峰面积：混煎液＞单煎混合液。结论 桂枝甘草汤方药成分提取时以桂枝与甘草混煎为佳。

【关键词】  桂枝甘草汤；半仿生提取法；甘草次酸；肉桂酸；黄酮化合物；挥发油；指纹图谱

    abstract：objective to optimize the best ingredients combination of guizhi gancao decoction. method the prescription was put into two groups, and extracting by semi-bionic extraction. the contents of glycyrrhetinic acid, cinnamic acid, total flavones, volatile oil and dry extract in the each extract were determined, and hplc fingerprint of the refined by 50% ethanol was compared. results except the similar content of dry extract in two kinds of combinations, the other four index components in mixed extract is significantly higher than individual extraction. two kinds of combinations extract fingerprints of the hplc had no significant difference. hplc gradients eluting total score area and main characteristic peak area in mixed extract were higher than individual extraction. conclusion it is better that guizhi gancao decoction extracted with guizhi and gancao mixed.
    　
　　key words：guizhi gancao decoction；semi-bionic extraction；glycyrrhetinic acid；cinnamic acid；total flavones；volatile oil；hplc fingerprint
 
    桂枝甘草汤出自汉代张仲景的《伤寒论》,由桂枝、炙甘草组成,具有补心助阳、生阳化气、补阳扶中的功效。www.11665.COm临床用于心率失常具有较好效果。有研究表明,桂枝甘草汤对环磷酰胺诱发的姐妹染色体互换及微核升高具有较强的抑制作用[1-2]。但目前桂枝甘草汤的应用仍以汤剂为主,方药的提取多采用水提法,存在挥发性成分易损失、易霉变、服用不便等缺点。本试验在用均匀设计优选出桂枝甘草汤半仿生提取法(简称sbe法)工艺条件的基础上,将方中药材组合成2组,用优选出的sbe法工艺条件提取,提取液作甘草次酸、肉桂酸、总黄酮、挥发油、干浸膏的含量测定及50%乙醇精制液的hplc指纹图谱比较,优选出桂枝甘草汤方药提取时药材的最佳组合方式。

　　1  仪器与试药

    lc-10a型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；754紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；phs-3c型精密ph计(上海雷磁仪器厂)；fa1004型电子分析天平(上海第二分析仪器厂)；lxv-ⅱ型离心沉淀机(上海第二分析仪器厂)；kq-250e型医用超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；色谱柱：phenomenex ods3(5 μm,4.6 mm×150 mm)；spd-10avp紫外检测器；re-52aa型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。
   
　　药材经鉴定,桂枝为樟科植物肉桂cinnamomum cassia presl的干燥嫩枝,甘草为豆科植物甘草glycyrrhiza uralensis fisch.的干燥根及根茎。炙甘草：取炼蜜,加适量开水稀释后,淋入净甘草片中拌匀,闷润,置炒制容器内,用文火加热,炒至老黄色,不粘手时取出,放凉(每100 kg甘草用炼蜜25 kg)。
   
　　甘草次酸、肉桂酸、柚皮苷对照品(中国药品生物制品检定所提供,批号分别为723-200109、710-200011、722-200107)；甲醇为色谱纯；水为三蒸水；其余试剂均为分析纯。

　　2  方法与结果

　　2.1  药材的组合方式

    将桂枝、甘草排列组合成2组,即单煎混合组和混煎组。混煎组为桂枝、甘草合煎；单煎混合组为桂枝、甘草分别单煎后合并2种浓缩液。

　　2.2  提取液的制备

    将处方药材分别粉碎,过10～20目筛,按处方比例(桂枝∶甘草＝2∶1)分别称取桂枝粗粉80 g、炙甘草粗粉40 g,按“2.1“项下组合方式,用sbe法分别提取3次(双提法：第1次用水用0.1 mol/l hcl调至ph为2.04,第2、3次用水用0.1 mol/l naoh调至ph为7.25、8.51；加水量依次为药材重量的10、8、8倍；煎煮时间依次为190、95、45 min；双提法提取的挥发油单独存放),分别滤过,离心,合并上清液,水浴浓缩至400 ml。同法制备甘草、桂枝单煎液,即得(每1ml相当于原药材0.3 g)。

　　2.3  供试液的制备

    精取提取液各10 ml,加水35 ml,缓缓加入盐酸4 ml,静置30 min,待气泡消失后,再加盐酸1 ml、氯仿30 ml,水浴加热回流1.5 h,放冷,移至分液漏斗中,静置,分取氯仿层,水层用氯仿萃取(20 ml×2),回收氯仿,残渣用无水乙醇定容至25 ml,得供试液a(每1ml相当于原药材0.12 g)。

    精取提取液各15 ml,分别置蒸发皿中,加硅藻土4 g,拌匀,水浴蒸至近干,80 ℃烘干,研细,加乙酸乙酯40 ml,超声提取20 min,滤过,回收乙酸乙酯,残渣用甲醇定容至5 ml,得供试液b(每1ml相当于原药材0.9 g)。

    精取提取液各15 ml,分别置蒸发皿中,加硅藻土4 g,拌匀,水浴至近干,80 ℃烘干,研细,用甲醇100 ml索氏回流5 h(提至无色),滤过,用甲醇定容至100 ml,得供试液c(每1 ml相当于原药材0.045 g)。

    精取提取液各15 ml,分别置蒸发皿中,加硅藻土4 g,拌匀,水浴蒸至近干,80 ℃烘干,研细,用50%乙醇100 ml索氏回流4 h (提至无色),滤过,用甲醇定容至100 ml,得供试液d(每1 ml相当于原药材0.045 g)。

　　2.4  对照品溶液的制备

    精密称取甘草次酸对照品1.70 mg,用无水乙醇配制成0.34 mg/ml的溶液。精密称取肉桂酸对照品2.20 mg,用甲醇配制成0.22 mg/ml的溶液。精密称取甘草酸铵对照品1.60 mg,用50%乙醇配制成0.32 mg/ml的溶液。精密称定柚皮苷对照品2.00 mg,用甲醇配制成1.00 mg/ml的溶液。

　　2.5  甘草次酸含量测定

　　2.5.1  色谱条件 

　　检测波长250 nm；柱温：35 ℃；灵敏度：1.0aufs；流动相：甲醇-水(84∶16)；流速：1.00 ml/min；进样量：20 μl。在上述色谱条件下,甘草次酸与其他成分可达到基线分离,分离度大于1.5,理论塔板数1 981。

　　2.5.2  线性关系考察 

　　精取甘草次酸对照液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml,分别用无水乙醇定容至1 ml,各取20 μl进样,按“2.5.1”项下条件依法测定峰面积。以进样量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,结果甘草次酸在0.68～6.8 μg范围内,其质量(μg)与峰面积呈良好的线性关系,回归方程：y＝1.008 434×106x＋104 180,r＝0.999 2。

　　2.5.3  样品含量测定 

　　取供试液a,用0.45 μm微孔滤膜滤过,精取滤液各20 μl,进样,按“2.5.1”项下色谱条件测定,结果见表1,色谱图见图1。表1  2种组合提取液中甘草次酸的含量测定结果(略)注：与单煎混合液比较,☆☆☆p＜0.001

　　2.6  肉桂酸含量测定

　　2.6.1  色谱条件 

　　检测波长267 nm；柱温：35 ℃；灵敏度：1.0 afus；流动相：甲醇-0.1%磷酸(52∶48)；流速：1.00 ml/min；进样量：20 μl。在上述色谱条件下,肉桂酸与甘草次酸均可达到基线分离,分离度大于1.5,理论塔板数2 778。

　　2.6.2  线性关系考察 

　　精取肉桂酸对照液0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 ml,分别加甲醇定容至1 ml,各取20 μl进样,测定峰面积。以进样量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,结果肉桂酸在0.11～0.44 μg范围内,其质量(μg)与峰面积呈良好的线性关系,回归方程：y＝7.467 7×106x＋123 315.29,r＝0.999 8。

　　2.6.3  样品含量测定 

　　取供试液b,用0.45 μm微孔滤膜滤过, 进样20 μl,按“2.6.1”项下色谱条件测定,结果见表2,色谱图见图2。表2  2种组合提取液中肉桂酸的含量测定结果(略)注：与单煎混合液比较,☆☆p＜0.01

　　2.7  总黄酮含量测定

　　2.7.1  线性关系考察 

　　精取柚皮苷对照液0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 ml,加入甲醇1 ml,再加入10%koh溶液0.5 ml,室温放置5 min,用甲醇稀释并定容至10 ml,以甲醇作空白对照,在412 nm处测定吸收度。以浓度c(μg/ml)为横坐标,吸光度(a)为纵坐标,绘制标准曲线,结果总黄酮的线性范围为20～100 μg/ml,回归方程：a＝0.052 17c－0.019 7,r＝0.996 4。

　　2.7.2  样品含量测定 

　　精取供试液c各4 ml,用甲醇稀释并定容至100 ml。取上述稀释液1 ml,加10%koh溶液0.5 ml,室温放置5 min,用甲醇稀释至10 ml,在412 nm处测定吸收度。另取上述稀释液1 ml,用甲醇稀释至10 ml,作为空白对照。总黄酮的含量以柚皮苷计算,结果见表3。表3  2种组合提取液中总黄酮的含量测定结果(略)注：与单煎混合液比较,☆☆p＜0.01

　　2.8  干浸膏得量测定

    精取“2.2”项下提取液各10 ml,分别置恒重的蒸发皿中,水浴蒸干,烘至恒重,计算干浸膏得量,结果见表4。表4  2种组合提取液中干浸膏得量测定结果(略)

　　2.9  挥发油的含量测定

    按2005年版《中华人民共和国药典》(二部)附录xd挥发油测定法(甲法)[3]测定,结果见表5。表5  2种组合提取液中挥发油的含量测定结果(略)注：与单煎混合液比较,☆p＜0.05

　　2.10  hplc指纹图谱比较

　　2.10.1  色谱条件 

　　检测波长254 nm；柱温：35 ℃；灵敏度：1.0 afus；流动相：甲醇-0.1%磷酸；甲醇(5%)4 min,甲醇(28%)→甲醇(52%)11 min,甲醇(52%)→甲醇(84%)10 min,甲醇(84%)→甲醇(100%)10 min；流速：1.00 ml/min；进样量：20 μl。

　　2.10.2  hplc图谱的测定比较 

　　取供试液d分别进样,进行色谱分析。结果总峰面积：单煎混合液为9 215 519,混煎液为13 299 913。以保留时间15.190 min色谱峰的保留时间为1.0,计算2种组合提取液的主要特征峰的相对保留时间,结果2种组合提取液中主要特征峰的相对保留时间基本一致。主要特征峰的峰面积见表6,色谱图见图3、图4。表6  hplc图谱中主要特征峰的峰面积（略）

    hplc指纹图谱显示,在此分析范围内,2种组合提取液的色谱峰数及峰位基本一致,说明二者的成分基本一致。主要特征峰的总峰面积：混煎液＞单煎混合液,尤以3、10号峰峰面积相差较大。主要特征峰占总峰面积比例,单煎混合液为52.68%,混煎液为58.63%,二者差别不大。

　　3  小结与讨论

    我们将桂枝甘草汤方药组合成2组,用均匀设计优选出的sbe法工艺条件进行提取,提取液作甘草次酸、肉桂酸、总黄酮、挥发油、干浸膏的含量测定及50%乙醇精制液hplc指纹图谱比较。结果除干浸膏含量单煎混合液与混煎液相近外,其余4个指标成分的含量,混煎液均明显高于单煎混合液。其中甘草次酸、肉桂酸的含量,混煎液分别是单煎混合液的2.53和1.88倍。2种组合提取液hplc指纹图谱无明显差异。hplc梯度洗脱总峰面积及主要特征峰峰面积：混煎液＞单煎混合液。综合以上实验结果,认为桂枝甘草汤方药成分提取时以桂枝、甘草混合提取为佳。本结果表明,2种组合水提取液中甘草次酸、肉桂酸、总黄酮、挥发油含量,混煎液明显高于单煎混合液,说明桂枝与甘草配伍后利于其有效成分的溶出,同时也说明古方将二者配伍入汤剂是有其科学道理的。

【参考文献】
  　　[1] 沈建伟,王明艳,赵凤鸣,等.两种中药复方拮抗环磷酰胺致突变作用的研究[j].癌变·畸变·突变,1999,11(1)：38.

　　[2] 王明艳,吴海涛,赵鸣芳,等.4种方药对环磷酰胺诱发的sce的抑制作用[j].中成药,2000,22(3)：212.

　　[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[s].北京：化学工业出版社,2005.附录xd.