作者：王平，陈丹龙，朱兴一，忙怡丽，苏为科

【摘要】  目的研究用闪式提取器从银杏叶中提取银杏萜类内酯的工艺。方法用正交实验进行提取方法的研究，用高效液相色谱（hplc）法测定银杏内酯的含量，流动相为甲醇-水(30∶70)，流速为0.8 ml/min，用蒸发光散射检测器，柱温为30 ℃。结果闪式提取银杏叶萜类内酯的合适工艺为：植物粒径50目，提取时间5 min，乙醇浓度60%，液固比20∶1，此条件下萜类内酯提取率平均值可达1.712 mg/g 。结论闪式提取是一种有效的提取银杏萜类内酯的方法。

【关键词】  闪式提取； 银杏叶； 萜类内酯

银杏ginkgo biloba l.为银杏科银杏属植物，又名公孙树，为现存古代孑遗植物之一，是我国的特产植物［1］。银杏叶中主要含有银杏内酯以及黄酮类等化合物，具有益心敛肺、化湿止泻等作用。银杏内酯作为银杏叶的提取物具有抗凝血、防治动脉粥样硬化、保护缺血损伤组织、抗休克、抗炎等诸多药理作用，能有效的抑制多种诱导剂所诱导的血小板聚集，并且银杏内酯已被认为是高效特异的paf拮抗剂［2～4］。银杏内酯主要包括银杏内酯a，b，c和白果内酯，简称为ga，gb，gc，bb。
   
　　目前，对于银杏内酯的提取，主要采用的是乙醇溶液加热回流的方法。www.11665.Comyang chun等［5］尝试采用超临界二氧化碳法提取银杏内酯，虽然提取效果较好，但由于操作繁琐，设备成本高，本方法目前并未得到广泛的应用。近年来，闪式提取技术是利用高速机械剪切力和搅拌力，迅速破坏植物细胞组织，使组织细胞内部的有效成分与溶剂充分接触，使有效成分快速溶解［6，7］，应用该方法对氨基酸、蛋白质、萜类和黄酮类化学物等物质的提取已有文献报道，表明其具有缩短提取时间，提高提取效率，简化操作步骤的特点，但将此方法应用到银杏叶中银杏内酯的提取的研究尚未见文献报道。本文报道用闪式提取技术提取银杏叶中银杏内酯，取影响闪式提取的主要因素即粒径大小、提取时间、乙醇浓度和液固比4个因素，各取3个水平进行l9(34)正交实验，用液相色谱法检测银杏内酯提取率，并以此为评价指标，确定最佳工艺条件。

　　1  器材

　　1.1  材料与试剂银杏叶由浙江康恩贝制药股份有限公司提供；银杏萜类内酯（白果内酯及银杏内酯a、b、c）标准品购自中国药品生物制品检定所；hplc甲醇为色谱纯试剂；乙醇为分析纯试剂。

　　1.2  仪器dfy-500摇摆式粉碎机（上海鼎广机械设备有限公司制造）；dzf真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司制造）；re-52aa旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂制造）；fsh22可调闪式提取器(郑州金星科技有限公司制造)；waters液相色谱仪（安捷伦科技有限公司制造）。

　　2  方法

　　2.1  银杏萜类内酯的闪式提取采用正交实验l9(34)进行闪式提取银杏萜类内酯的研究，正交实验的因素水平表见表1。称取粉碎后的干燥银杏叶粉末40 g倒入到闪式提取器的铁罐中，加入适量乙醇溶液，打开闪式提取器，破碎细胞壁。实验完成后取出，冷却，过滤，经旋转蒸发仪浓缩至无醇味即得浸膏。

　　2.2  色谱条件色谱柱为diamonsil(tm)c18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相为甲醇-水(30∶70)，流速0.8 ml/min；蒸发光散射检测器（elsd）：漂移管温度104 ℃，载气流速2.9 ml/min；柱温为30℃。表1  因素水平（略）

　　2.3  线性范围考察分别精密称取对照品ga，gb，gc，bb 各3，3，3，4 mg置于10 ml量瓶中甲醇加至刻度，摇匀即得混合对照品溶液，取5，2.50，0.50，0.25，0.05 ml,分别置于10 ml量瓶中加甲醇到刻度，摇匀，即得混合对照品溶液,分别吸取溶液20 μl，注入hplc仪测定。以对照品浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。

　　2.4  样品溶液的制备取实验得到浸膏，加10 ml水和1滴2%盐酸，用醋酸乙酯振摇萃取4次（15，10，10，10 ml）。合并后用5%醋酸钠20 ml洗涤，洗涤液用10 ml醋酸乙酯萃取，合并醋酸乙酯萃取液后用水洗涤两次，20 ml/次。合并水层，用10 ml醋酸乙酯萃取，合并醋酸乙酯萃取液，回收醋酸乙酯后加10 ml甲醇，用于进样。

　　2.5  精密度实验取最小浓度对照品溶液，重复进样5次，记录色谱峰面积，计算rsd。

　　2.6  重复性实验精密称取同批银杏叶粉末40 g，共5份，按“样品溶液的制备”项下方法操作，制备样品溶液6份，进行含量测定，计算rsd。

　　2.7  稳定性实验取一个样品，每隔2 h进样1次，共进样5次，考察供试品溶液的稳定性。

　　2.8  回收率实验取已测知含量的样品5份，分别精密加入对照品适量，依hplc法测定，计算回收率，rsd。

　　2.9  最佳工艺验证按照优化工艺条件操作，测定银杏萜类内酯含量。

　　3  结果

　　3.1  hplc结果及标准品线性关系在前述色谱条件下，各种银杏内酯能够很好地分离(见图1)，以对照品浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。回归方程为：白果内酯y=0.563 12x-2.567 32，r=0.998；银杏内酯a y = 0.34856x-3.15764，r=0.997；银杏内酯b y = 0.456 78x-4.456 24，r=0.997；银杏内酯c y=0.323 55x-3.234 13，r=0.999。

　　3.2  闪式提取银杏萜内酯正交实验结果在本实验范围内见表2，各因素对提取效果的影响程度依次为：a（颗粒大小）>b（提取时间）>c（乙醇浓度）>d（液固比）。a因素影响差异有高度显著性，b和c因素影响差异有显著性。比较k值，得较好的因素水平组合为a2b1c3d2，与单因素实验的最优因子组合一致。即颗粒大小为50目，提取时间为5 min，乙醇浓度为60%，液固比为20∶1。

　　3.3  精密度实验结果取最小浓度对照品溶液，重复进样5次，记录色谱峰面积，计算得的rsd为1.34%。

　　3.4  重复性实验精密称取同批银杏叶粉末40 g，共5份，按“样品溶液的制备”项下方法操作，制备样品溶液5份，进行含量测定，计算rsd为1.56%。

　　3.5  稳定性实验 取一个样品，每隔2 h进样1次，共进样5次，记录色谱峰面积，计算所得rsd为 0.34%。

　　3.6  回收率实验取已测知含量的样品5份，分别精密加入对照品适量，依hplc法测定。银杏萜内酯平均回收率为98.75%，rsd为0.83%。本研究的hplc测定法的回收率较好，方法是可行的。

　　表2  正交试验结果（略）

　　3.7  工艺验证实验根据优化的正交实验结果颗粒大小为50目，提取时间为5 min，乙醇浓度为60%，液固比为20∶1，进行3批银杏叶的萜类内酯提取率分别是1.700，1.716，1.720 mg/g。平均提取率为1.712 mg/g，说明正交设计筛选的工艺是合理的。

　　4  讨论
   
　　闪式提取银杏叶萜类内酯实验中，各因素对萜类内酯提取率的影响程度依次为：a（颗粒大小）>b（提取时间）>c（乙醇浓度）>d（液固比），并由此得到合适的提取工艺条件：植物粒径50目，提取时间5 min，乙醇浓度60%，液固比20∶1，此条件下萜类内酯提取率平均值可达1.712 mg/g。本文首次报道了用闪式提取银杏中的萜类内酯的研究，利用高速机械剪切力和搅拌力，迅速破坏植物细胞组织，使组织细胞内部的萜类内酯与溶剂充分接触，使有效成分快速溶解。该提取适用于工业化生产的放大工艺正在进一步研究中。

【参考文献】
  　［1］庄向平,虞杏英,杨更生，等. 银杏叶中黄酮含量的测定和提取方法［j］. 中草药, 1992, 23 (3) : 122.

　　［2］wu yuzhou, li shuqin, cui wei et al. ginkgo biloba extract improves coronary blood flow in healthy elderly adults: role of endothelium-dependent vasodilation［j］. phytomedicine, 2008, 15 (3) : 164.

　　［3］elaheh nooshinfar, reza lashgari, abbas haghparast et al. nmda receptors are involved in ginkgo extract-induced facilitation on memory retention of passive avoidance learning in rats［j］. neurosci. lett., 2008, 432 (3) : 206.

　　［4］rodríguez m., ringstad l., sch?fer p. et al. reduction of atherosclerotic nanoplaque formation and size by ginkgo biloba (egb 761) in cardiovascular high-risk patients［j］. atherosclerosis, 2007, 192 (2) : 438.

　　［5］yang chun, xu yanrong, yao weixi. extraction of pharmaceutical components from ginkgo biloba leaves using supercritical carbon dioxide［j］. j. agric. food chem., 2002, 50 (4) : 846.

　　［6］邓引梅,宋发军,崔永明，等. 甘草叶总黄酮提取工艺［j］. 中南民族大学学报, 2008, 27 (1) : 127.

　　［7］刘延泽. 植物组织破碎提取法及闪式提取器的创制与实践［j］. 中国天然药物, 2007, 6 (5) : 401.