【摘要】 dna鉴定技术在现代法医物证检验中有着广泛的应用，其应用分子生物学的方法，对犯罪现场遗留的生物物证所含的dna与犯罪嫌疑人的dna样本进行比对，鉴定dna结构是否相同，从而对生物物证是否来自于犯罪嫌疑人作出评价。不过大多犯罪现场遗留的生物样本存在着许多不利于法医提取的因素，比如腐败、变质、污染等。本文就现场dna提取纯化技术方面来介绍当今法医学的技术进展。
【关键词】 dna 提取 硅珠 磁珠
自从20世纪80年代dna技术问世以来，改变了过去对生物物证的检验只能“否定”不能“认定”的历史。利用dna鉴定技术，可以直接“认定”犯罪现场的血迹、精斑、毛发、唾液斑等生物检材是否为犯罪嫌疑人所留，从而为案件的侦破、诉讼提供有力的证据。目前，dna鉴定技术在生物物证检验中的应用非常广泛，在伤害、强奸、交通肇事、亲子鉴定等刑事或民事案件中，现场遗留的血迹、精斑、骨骼、肌肉、毛发、唾液斑、尿斑、指(趾)甲、汗液指纹等生物物证都是dna鉴定的常见检材，dna鉴定结论是许多刑事案件的重要证据之一。
众所周知，要想对dna进行鉴定，必须得到足量且纯净的dna样本， dna提取纯化技术是法医dna检验的第一个步骤，也是最关键的步骤。从犯罪现场提取的血痕或精斑，或者是从嫌疑人或亲缘鉴定中提取的血液样本，这些生物检材中除了dna外还包括许多物质，在分析dna之前，必须将dna同其他物质分离开来。WwW.11665.coM可以说，能否成功进行dna检验取决于能否从生物检材中获得高质量dna。尤其对于腐败、变质、污染等各种条件下的现场生物检材，dna的提取质量将直接关系到dna检验的成败。
目前法医dna实验室最常见的2种dna提取方法是：酚-氯仿提取法、chelex提取法。虽然这些方法是被广泛应用于法医学检材，但是不得不承认，他们各自都有着不可避免的缺点。
酚-氯仿提取法：在dna提取过程中，涉及到一些危险的化学物质，耗时。而且有些色素和泥土中能被醇沉的杂质不易被去除。同时，由于操作中涉及到多次转移样本，这样很容易造成dna丢失，dna提取率低，增加错误或污染的几率。[2]
chelex提取法：该方法虽然提取dna量较多，但对微量、污染的检材效果欠佳。而且该方法提取的dna中常存在pcr扩增抑制物，且不宜长期保存，这些都可能使扩增效率下降或扩增失败。[1-3]
由此看到，虽然这些方法可以提取出较多的dna样本，但是由于提取纯度较低，含有较多pcr抑制物，影响了接下来的扩增过程，这样也就影响了dna的检验。所以如何能提取出较纯净的dna显得十分的必要。在此，我想介绍两种更为有效的dna提取纯化技术。
1 以二氧化硅为基础的提取纯化法
这种方法是近几年才发展起来的高通量dna提取纯化方法。其中最多见的就是以硅珠或硅膜为基础的提取方法。其基本原理是[4-6]，核酸在高浓度高离液盐例如氢氯酸胍、硫氰酸胍、碘化钠和高氯酸钠环境中，通常用的是硫氰酸胍，选择性地吸附在类似玻璃珠的硅支持物上。这些高离液盐可破坏液态水中的氢键网格，使变性的蛋白质和核酸比其在折叠或配对结构的情况下更具有热力学稳定性[7]。由于硫氰酸胍是高性能的蛋白质变性剂，可以使蛋白质与dna分离，在硅支持物吸附前高速离心可以将变性的蛋白质、杂质等不容物除去，吸附后漂洗可以将溶液中的pcr抑制物除去，因此提取的dna比较纯，速度快，且不会受检材条件影响。
实验表明[8]，0.5-1μl新鲜血液就可以提取出足以成功扩增的dna。在不同的检材，如新鲜脑组织、皮肤、泥土上血迹、深色布血迹、火场尸体骨松质、深色布混合斑中提取的dna均可成功扩增，不受检材种类的影响。同时，通过对chelex法，酚-氯仿法和二氧化硅膜法3种dna提取法在污染严重混合斑分型中的应用效果的比较[2]，发现二氧化硅膜纯化技术可以有效去除pcr抑制物，提取的dna扩增效果明显优于chelex法和酚-氯仿法，具有较高的应用价值。
2 纳米磁珠法
纳米科技是近年来国际上最为活跃的研究领域之一，取得了诸多举世瞩目的成就，尤其是在解决生物学、医学难题上展示了广阔的应用前景。磁性纳米技术是纳米技术的一个分支，对于dna提取技术而言，磁性纳米技术将具有常规提取方法所无法比拟的独特优势，因此将磁性纳米技术应用在法医学界将有着广泛的前景。而磁珠提取法就是其中最常见的方法。磁珠的主要制作步骤是这样的[9]：首先制备5-8nm的磁性纳米粒子，使其具有很高的磁场响应能力和超顺磁特性，能够通过改变外磁场实现纳米调控；然后利用包覆技术，对磁性纳米粒子进行包覆，为进一步修饰功能团提供载体，减少与生物组织的非特异性作用，对内部的磁性纳米粒子起到保护作用；接着利用表面化学修饰技术，连接可特异地与dna发生作用的功能团[10]，修饰的功能团必须具有对dna可逆吸附的特性，从而实现控制dna吸附、解离和减少与其它杂质非特异性吸附的目的；最后通过表面修饰和溶液中离子强度、ph等条件的控制，使每次操作均能获得准确数量dna，保证后续检测分析的高成功率。
磁珠法提取纯化dna的原理与硅珠相近[11,13]，先利用硫氰酸胍等强烈蛋白变性剂，破坏细胞膜及核膜蛋白，释放dna，并使核酸酶失活；然后加入磁珠通过表面的化学集团与dna特异性吸附，而蛋白质等杂质不被吸附而留在容夜里；接着在磁场的作用下，磁性颗粒与液体分开，回收颗粒；最后再用纯水或te洗脱吸附的dna，在溶解液中进行dna与磁珠的解离，将dna重新溶出。
与其他常见提取方法比较，磁珠法有着显著的优势[9,12]:1纳米材料具有小尺寸效应和表面效应，能够用于高效dna提取，满足微量生物样本dna提取的要求，实验表明，即使是0.5μl血仍能得到dna分型，而同样的血量用chelex提取dna优势不能得到分型，甚至当溶液中dna含量仅为100pg时，dna回收率仍然达到90%以上[13]；2纳米材料表面能够进行化学修饰，从而与dna进行特异性吸附，去除样品dna溶液中的pcr抑制物质，如有机溶剂、去污剂、金属离子、染料等；3纳米粒子表面功能团数量可以控制，获得所提取dna溶液的浓度信息，实现定量的要求；4磁性纳米材料可以通过特殊的合成工艺，使其具有超顺磁特性，因此能够通过仪器进行自动化操作，满足数据库建设大批量样本提取的需要，减少人为因素影响[14]；5用时少，操作简单，适用于大多数生物检材。对于经验较少的初学者而言，按照简单的程序化操作，也能够获得满意的dna提取结果；6价格低廉，便于广泛应用。由于纳米材料合成采用的都是低价无机和有机原料，无须特殊的仪器设备，使得最终的合成和研发成本都很便宜。
dna鉴定技术作为法医鉴定的重要手段，它的科学性和实用性已得到广大司法部门和社会各界的一致认可和高度重视。目前运用dna技术在刑事案件以及各种案件中进行检验已经是常用手段之一。而以上介绍的技术也只是整个鉴定技术的一环，样本的收集、str分型等一系列步骤的每个因素都可能影响dna分析结果。不过相信在科学技术迅猛发展的今天，国内外学者会研究出更多更灵敏，更简便，更经济的方法，来未法医学界或者更大的领域服务。
参 考 文 献
[1]董林芳, 裴黎, 余政, 彭健雄, 冯涛. 联合应用chelex100 和磁珠法检测霉变皮上衣微量dna 1例[j]. 刑事技术. 2008; 6: 68-69.
[2]莫耀南, 薛小琦, 刘良. 3种dna提取法在污染严重混合斑分型中的应用比较[j].中国法医学杂志. 2008; 23(1): 26-28.
[3]walsh ps, metzger da, higuchi r. chelex-100 as a medium for simple extraction of dna for pcr based typing from forensic material [j]. biotechniques. 1991 apr; 10(4): 506-513.
[4]oota h, saitou h, matsushita t, ueda s. molecular genetic analysis of remains of a 2000-year-old human population in china and its relevance for the origin of the modern japanese population. am j hum genet. 1999 jan; 64(1): 250-258.
[5]schneeberger c, kury f, larsen j, speiser p, zeillinger r. a simple method for extraction of dna from guthrie cards. pcr methods appl. 1992 nov; 2(2): 177-179.
[6]duncan e, setzke e, lehmann j. isolation of genomic dna. in bowien b and durre p. (eds) nucleic acids isolation methods. stevenson ranch, california: american scientific publishers. 2003; 7-19.
[7]tereba am, bitner rm, koller sc, kephart dd, ekenberg sj. simultaneous isolation and quantitation of dna. u.s. patent. 2004; 6: 631-673.
[8]王林生, 苏勇, 顾林岗. 硅珠法提取pcr模板dna[j]. 中国法医学杂志, 2000; 15(1): 36-37.
[9]杨百全, 李晨旭, 付伟东, 陈霞, 李祥顺. 用于dna提取的磁性纳米技术[j]. 刑事技术. 2004; 171(12增刊): 44 - 45.
[10]sauzedde f, elaissari a, pichot c. hydrophilic magnetic polymer latexes. 1. adsorption of magnetic iron oxide nanoparticles onto various cationic latexes[j]. colloid polym sci. 1999; 277: 846-855.
[11]郑秀芬, 凌凤俊, 涂政, 叶健. 模板dna磁珠提取法. 中国法医学杂志. 2003; 18(2): 107-108.
[12]杨百全, 陈霞.纳米技术与法医dna检验[j]. 刑事技术. 2003; 8(4):29-31.
[13]杨百全, 王利君, 遇长青, 李晨旭, 杨文胜, 鲍玉庆. 磁珠法回收纯化dna样本.中国法医学杂志. 2006; (21增刊): 10-11.
[14]nagy m, otremba p, krüger c, bergner-greiner s, anders p, henske b, prinz m, roewer l. optimization and validation of a fully automated silica-coated magnetic beads purification technology in forensics. forensic sci int. 2005 aug 11; 152(1): 13-22.
