【摘要】 目的 探讨l-精氨酸(l-arginine，l-arg)预处理对硬化肝脏缺血再灌注(ischemia-reperfusion，i/r)损伤的保护作用及机制。方法 采用硫代乙酰胺(thioacetamide，taa)复制大鼠肝硬化模型，然后阻断第5叶入肝血流30 min，再灌注60 min，建立部分肝缺血再灌注模型。24只肝硬化大鼠随机分成4组(n=6)：?譹?訛肝硬化大鼠对照组(对照组)，仅分离肝周围韧带，不进行肝门阻断及再灌注;?譺?訛肝硬化缺血再灌注组(缺血再灌注组);?譻?訛l-精氨酸预处理组(精氨酸组);?譼?訛l-硝基精氨酸甲酯(l-nitro-arginine-methy l-ester，l-name)预处理组(硝基精氨酸甲酯组)。后三组分别于缺血前15 min经门静脉给予生理盐水、l-arg和l-name处理，测定再灌注后肝内门-体分流、血清门冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase，ast)、丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，alt)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，ldh)和肝组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，sod)、丙二醛(malondialdehyde，mda)、一氧化氮(nitric oxide，no)、三磷酸腺苷酶(adenosine triphosphatase，atpase)等的变化。采用门静脉连续输注山梨醇法，测定肝脏山梨醇摄取率，计算肝内门-体分流。wWw.11665.CoM结果 缺血再灌注组与对照组比较：功能性肝血流量(functional hepatic blood flow，fhbf)、sod显著降低(p<0.01)，肝内分流率、肝内分流量(intrahepatic shunt flow，ihsf)、mda、alt、ast、ldh显著升高(p<0.01或p<0.05);精氨酸组与缺血再灌注组比较：no、fhbf、sod、na+/k+-atpase、ca2+-atpase、mg2+-atpase显著升高(p<0.01或p<0.05)，肝内分流率、ihsf、mda、alt、ast、ldh显著下降(p<0.01或p<0.05);硝基精氨酸甲酯组与缺血再灌注组比较：no、fhbf显著下降(p<0.01)，ihsf、mda显著升高(p<0.01)。结论 l-arg对硬化肝脏缺血再灌注损伤有保护作用，其保护机制是通过增加肝脏内源性no，从而减少肝内门-体分流，增加功能性肝血流以及改善细胞能量代谢而实现的。
【关键词】 肝脏;肝硬化;缺血再灌注损伤;肝内门-体分流;一氧化氮;山梨醇;l-精氨酸;大鼠
protective mechanism of l-arginine against liver ischemic-reperfusion injury in the rat model of liver cirrhosiszhang zhiqiang， cai bing， wu mingyu. department of hepatobiliary surgery， the people’s hospital of wuxi city， wuxi 214023abstract objective to explore and investigate protective mechanism of l-arginine against liver isohemic-reperfusion (i/r) injury in a rat model of liver cirrhosis. methods cirrhotic rats were induced by oral administration of thioacetamide (taa). the rats underwent partial hepatic ischemia-reperfusion. twenty-four cirrhotic rats were randomly divided into 4 groups (n=6). the control group was also served as the sham-operated control. other three groups were subjected to 30 min lobar ischemia and 60 min reperfusion. of them， groups i/r， l-arginine (l-arg) and l-name were preconditioned with normal saline， l-arg and l-nitro-arginine-methy l-ester (l-name) respectively. all drugs were injected through catheters in the distal ileocolic veins. intraportal infusion of sorbitol (10 mmol/l， 0.2 ml/min) commenced after 60 min reperfusion， at the same time， blood sample was drawn from the jugular vein catheter for biochemistry test， such as alanine aminotransferase (alt)， aspartate aminotransferase (ast) and lactate dehydrogenase (ldh). two minutes after initiation of sorbitol infusion， blood samples were drawn simultaneously from the carotid artery， portal venous and hepatic venous catheters for sorbitol concentration assay. portal venous flow (pvf) and hepatic arterial flow (haf) were measured via electromagnetic flow probes. hepatic sorbitol uptake and intrahepatic shunt flow (ihsf) were calculated by pvf， haf and sorbitol concentrations in the portal vein， hepatic vein and carotid artery. on the termination of experiments， lesion liver lobes excised for histochemical assay， such as superox
肝脏手术中出血以及肝血流阻断都会造成肝脏缺血再灌注损伤，而大部分需要外科手术的病肝存在不同程度的肝硬化，肝硬化肝脏对缺血更敏感，也更易发生再灌注损伤。缺血再灌注损伤已经成为硬化肝脏手术后的主要死因。硬化肝脏缺血再灌注损伤机制还不是很清楚，目前尚缺乏有效防治硬化肝脏缺血再灌注损伤的方法。
近年研究表明[1-2]，正常肝脏及硬化肝脏均存在肝内门-体分流(intrahepatic portal systemic shunting，ipss)。另有研究表明[3-4]，在硬化肝脏及其缺血再灌注损伤中，血管活性物质一氧化氮(nitric oxide，no)及一氧化氮合酶明显紊乱，no有可能参与了ipss的调控。我们以肝硬化大鼠肝脏缺血再灌注为模型，以l-精氨酸(l-arginine，l-arg)提供氮源，研究no能否通过调节ipss，增加功能性肝血流量(functional hepatic blood flow，fhbf)，改善细胞能量代谢，从而保护肝脏，探讨预处理对硬化肝脏的保护机制。
1 材料和方法
1.1 肝硬化动物模型的建立 雄性sd大鼠(徐州医学院动物中心提供)，体质量250～300 g。在饮用水中加入硫代乙酰胺(thioacetamide，taa)，初始浓度为0.03%，自由饮水，颗粒饲料喂养每周根据体质量调整饮用水中taa浓度，每周体质量变化控制在15 g以内，共饲养12周，总体质量变化控制在60 g以内[5]。
1.2 实验分组 24只肝硬化大鼠随机分成4组(n=6)：?譹?訛肝硬化大鼠对照组(对照组);?譺?訛肝硬化缺血再灌注组(缺血再灌注组);?譻?訛l-精氨酸预处理组(精氨酸组);?譼?訛l-硝基精氨酸甲酯预处理组(硝基精氨酸甲酯组)。
肝脏缺血再灌注损伤模型及手术操作：参考李向农等[1]及molino等[6]山梨醇摄取率实验。2%戊巴比妥腹腔麻醉(0.15 ml/100 g体质量)，麻醉成功后，尾静脉缓慢注射肝素(30 u/100 g体质量)以达到肝素化。分别作左颈动脉插管用于颈动脉血样的采集，右颈静脉插管用于输液、输血及采血。选2根回结肠静脉插管，其中一根插入门静脉主干，用于门静脉血样采集和注射药物;另一根插入回结肠静脉内2 cm，连接微量注射泵，用于输注山梨醇。分离门静脉和肝动脉，置入口径合适的电磁血液流量计探头，测定血流量。22g套管针穿刺肝叶，潜行至肝静脉处，用于留取肝静脉血样。动脉夹完全阻断第5叶肝蒂30 min后再予开放60 min，即建立了部分肝缺血再灌注损伤模型。
对照组仅分离肝周围韧带，不进行肝门阻断及再灌注;其余三组阻断第5叶入肝血流30 min，再灌注60 min。其中，对照组于分离韧带后、缺血再灌注组于缺血前15 min经门静脉输注生理盐水(2.5 ml/kg体质量);精氨酸组和硝基精氨酸甲酯组于缺血前15 min分别经门静脉输注l-arg(300 mg/kg体质量[7])和l-name(10 mg/kg体质量)。再灌注60 min时(对照组于分离韧带后105 min后)，测定各组门静脉血流量(portal venous flow，pvf)及肝动脉血流量(hepatic arterial flow，haf)，经颈静脉导管取静脉血0.8 ml，待测血ast、alt、ldh。然后经门静脉输注d-山梨醇(10 mmol/l，0.2 ml/min)，2 min后同时经颈动脉、门静脉、肝静脉导管各取血1.0 ml。取血应缓慢、匀速，时间均控制在10 min，以保证生命体征平稳。为补偿充血容量损失，术中适当补充生理盐水约3 ml，取血期间经颈静脉输注预先准备的肝素化新鲜鼠血(0.1 ml/min)。血样注入离心管中，待测山梨醇浓度。取血结束后立即处死大鼠，迅速切下第5肝叶检测超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，sod)、丙二醛(malondialdehyde，mda)、no、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，nos)、钠/钾-三磷酸腺苷酶(na+/k+-adenosine triphosphatase，na+/k+-atpase)、ca2+-atpase、mg2+-atpase。
1.3 肝内门-体分流的测定 根据山梨醇代谢特点，肝脏山梨醇摄取率可代表fhbf占总肝血流量(total hepatic blood flow，thbf)的比例。采用门静脉连续输注山梨醇的方法，测定肝脏山梨醇摄取率。血山梨醇浓度用酶分光光度法测定[2-3]。由于颈动脉和肝动脉血中的山梨醇浓度相等，所以肝脏山梨醇摄取率用以下公式计算：
肝脏山梨醇摄取率(%)=■×100%
其中，spv、sca、shv分别表示门静脉、颈动脉、肝静脉的山梨醇浓度。
fhbf和肝内分流量(intrahepatic shunt flow， ihsf)分别用下列公式计算：fhbf=thbf×肝脏山梨醇摄取率;ihsf=thbf-fhbf。
1.4 血生化及肝组织生化定量分析 血清alt、ast、lah由au1000全自动生化分析仪检测。肝脏组织sod、mda、no、nos、atpase由南京建成生物工程研究所提供的试剂盒检测。
1.5 统计学方法 以均数±标准差表示，用sigmastat统计学软件对数据进行分析。对照组与缺血再灌注组比较采用t检验，缺血再灌注组、精氨酸组、硝基精氨酸甲酯组之间比较采用单因素方差分析(anova)q检验，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 山梨醇摄取率 对照组山梨醇摄取率为(72.0%±0.9%)，缺血再灌注组山梨醇摄取率较对照组显著降低(p<0.01)，精氨酸组山梨醇摄取率较缺血再灌注组有明显恢复(p<0.01)(见表1)。
2.2 肝脏血流动力学 缺血再灌注组pvf及thbf较对照组显著降低(p<0.05);精氨酸组pvf及thbf较缺血再灌注组显著升高(p<0.05);硝基精氨酸甲酯组pvf及thbf较缺血再灌注组显著降低(p<0.05);肝内分流率在对照组为(28.0%±0.9%)，缺血再灌注组显著升至(66.5%±6.3%)(p<0.01)，精氨酸组较缺血再灌注组显著降低(p<0.01)，硝基精氨酸甲酯组则显著升高至(72.6%±5.8%)(p<0.01);缺血再灌注组较对照组的ihsf明显增加而fhbf明显下降(p<0.01)，硝基精氨酸甲酯组fhbf进一步降低， 精氨酸组与缺血再灌注组比较，ihsf降低(p<0.05)，而fhbf显著升高(p<0.01)(见表2)。
2.3 血生化指标 缺血再灌注组alt、ast、ldh显著高于对照组(p<0.01);精氨酸组alt、ast、ldh则显著低于缺血再灌注组(p<0.01);硝基精氨酸甲酯组alt、ast、ldh分别与对照组比较差异无统计学意义(p>0.05)(见表3)。
2.4 肝组织生化指标 缺血再灌注组sod显著低于对照组(p<0.01)，而mda显著高于对照组(p<0.05);精氨酸组 sod显著高于缺血再灌注组(p<0.01)，而mda显著低于缺血再灌注组(p<0.01)，硝基精氨酸甲酯组mda却显著高于缺血再灌注组(p<0.01)(见表4)。
缺血再灌注组与对照组比较no以及nos均没有显著变化(p>0.05);精氨酸组no、总一氧化氮合酶(t-nos)、内皮型一氧化氮合酶(enos)均显著高于缺血再灌注组(p<0.01或(p<0.05)，硝基精氨酸甲酯组no显著低于缺血再灌注组(p<0.01)(见表5)。精氨酸组na+/k+-atpase、mg2+-atpase、ca2+-atpase均显著高于缺血再灌注组(p<0.01或p<0.05)(见表6)。
3 讨论
本研究表明：l-arg预处理对硬化肝脏i/r损伤有明显的拮抗作用，表现在肝酶alt、ast、ldh以及肝组织内氧自由基介导的脂质过氧化产物mda明显低于缺血再灌注组，而反映细胞能量代谢的na+/k+-atpase、mg2+-atpase、ca2+-atpase以及细胞内氧自由基清除剂sod明显升高，当用nos抑制剂l-name抑制no合成后，alt、ast、ldh、mda显著升高，提示肝脏损害加重，说明no在l-arg对硬化肝脏i/r损伤的保护中起了重要作用。
no是由nos催化底物l-arg生成。nos包括三种同工酶，即神经型(nnos)、内皮型(enos)和诱生型(inos)。肝内只有后两者，其中enos是血管内皮固有的，inos是由以内毒素为代表的细胞因子诱导巨噬细胞、内皮细胞、肝细胞等产生的[8-9]。虽然理论上肝硬化大鼠门静脉中内毒素水平较高并可在 i/r时进一步升高，刺激肝脏nos表达加强和no的合成增加，但我们的研究显示，硬化肝脏i/r后，肝脏组织no含量减少，但是差异无统计学意义(p>0.05)。这可能是由于内毒素等刺激所造成的nos表达加强及no合成增加与内皮细胞受损所造成的nos活性降低及no减少相抵消，故i/r后肝组织no含量变化不大。精氨酸组t-nos较缺血再灌注组显著升高(p<0.05)，主要体现在enos升高(p<0.01)，说明l-arg能够诱导肝内enos表达，并利用底物l-arg合成更多的no。
我们的研究显示，no和ipss具有密切的关系。李向农等的研究证实[1]，正常肝脏存在ipss。这些分流管道直径大多小于15 ?滋m，于窦前区起自门静脉末梢分支，绕过肝窦直接注入肝静脉。生理情况下这些分流处于关闭状态，当肝窦阻力升高时，ihsf可高达门静脉血流量的70%。血管铸型研究已经证实[2]，肝硬化肝脏存在大量门静脉-肝静脉吻合。我们通过测定山梨醇肝清除率发现，肝硬化大鼠存在大量的ipss，肝内分流率达(28.0%±0.9%)。当硬化肝脏再灌注时，缺血再灌注组肝内分流率显著增加至(66.5%±6.3%)(p<0.01)，fhbf也由对照组(6.1±0.7)ml/min/100 g body weight显著下降到缺血再灌注组的(2.4±0.4)ml/min/100 g body weight(p<0.01)，肝脏的有效灌注减少，进一步加重肝脏的损伤，从而参与了硬化肝脏的i/r损伤。肝脏损伤加重主要体现在血清ast、alt、ldh升高，肝脏mda增加，sod、atpase下降。缺血前给予no底物l-arg，再灌注后测定肝组织no含量为(0.86±0.11)?滋mol/gprot，显著高于缺血再灌注组(0.66±0.07)?滋mol/gprot(p<0.01);精氨酸组thbf较缺血再灌注组也显著增加，更为重要的是肝内血流分配发生了变化，即ihsf减少(p<0.05)，fhbf增加(p<0.01)。从精氨酸组与缺血再灌注组的比较中我们可以看出：thbf的增加主要是由于pvf增加所造成的，而haf无明显变化。缺血前给予非选择性nos抑制剂l-name，no较缺血再灌注组显著降低(p<0.01);随着no的减少， fhbf较缺血再灌注组也显著降低(p<0.05)，肝脏损伤加重，表现在较缺血再灌注组血清alt、ast和ldh升高(p<0.01)，肝组织mda增加(p<0.01)。l-arg预处理和l-name预处理，分别促进和阻断了硬化肝脏再灌注后肝脏内源性no的合成，继而分别增加和减少了fhbf，最终分别减轻和加重了肝脏的i/r损伤。l-arg预处理上调的no不但调节了ipss，还可以增加门静脉血流，更有效地增加fhbf。
通过本实验，我们认为l-arg预处理能够增加no合成，从而增加fhbf，发挥对肝硬化大鼠肝脏i/r损伤的保护作用。l-arg预处理还改善了细胞的能量代谢，表现在精氨酸组肝组织na+/k+-atpase、 mg2+-atpase、ca2+-atpase较缺血再灌注组显著升高(p<0.01)。l-arg预处理增加肝脏no含量的机制有以下几方面：?譹?訛缺血期因肝脏损伤而释放大量精氨酸酶，再灌注后进入体循环，使内源性l-arg消耗，no生成原料不足[10]。l-arg预处理为no的合成提供了底物。?譺?訛精氨酸组enos较缺血再灌注组显著升高(p<0.01)，提示l-arg能诱导肝细胞及内皮细胞enos表达增强，从而增加了肝脏组织no含量。?譻?訛当no发挥肝脏的保护作用后，有效灌注的改善也将提供更多的氧及atp，并使l-arg更有效地与肝细胞及内皮细胞作用，产生更多的no。
综上所述，我们的研究证明l-arg预处理对硬化肝脏i/r损伤具有保护作用。l-arg通过增加肝脏no含量，从而增加了fhbf，改善肝细胞能量代谢，发挥对硬化肝脏i/r损伤的保护作用。但确切机制还不很清楚，尤其在相关基因的转录和调控水平上所知甚少，有待更深入的研究。
【参考文献】
[1] li x， benjamin is， naftalin r， et al. location and function of intrahepatic shunts in anaesthetised rats[j]. gut，2003，52(9)：1339-1346.
[2] 张爱龙，杨镇，肖亮，等. 血吸虫病性门脉高压症兔肝脏微血管构造变化的研究[j]. 微循环学杂志，2007，17(2)：11-12.
[3] goh bj， tan bt， hon wm， et al. nitric oxide synthase and heme xygenase expressions in human liver cirrhosis[j]. world j gastroenterol，2006，12(4)：588-594.
[4] jorge gs， barbara l， aina rv， et al. increased oxidative stress in cirrhotic rat livers： a potential mechanism contributing to reduced nitric oxide bioavailability[j]. hepatology，2008， 47(4)：1248-1256.
[5] li x， benjamin is， naftalin r. reproducible production of thioacetamide-induced macronodular cirrhosis in the rat with no mortality[j]. j hepatol，2002，36(4)：488-493.
[6] molino g， avagnina p， ballare m， et al. combined evaluation of total and functional liver plasma flows and intrahepatic shunting[j]. dig dis sci，1991，36(9)：1189-1196.
[7] 董敏，陈秀芳，郑巧敏. l-精氨酸对糖尿病大鼠肝损伤的保护作用[j]. 中华老年多器官疾病杂志，2007，6(4)：267-269.
[8] thalmann s， jayet py， duplain h， et al. no， a major regulator of metabolic and cardiovascular homeostasis[j]. rev med suisse romande，2004，124(10)：639-641.
[9] 汤睿，孙瑞玥，周亚光，等. 内毒素耐受大鼠肺部inos和no表达的动态变化和意义[j]. 中国急救医学，2008，28(1)：42-45.
[10] langl f， roth e， steininger r， et al. arginase releases following liver reperfusion： eveidence of hemodynamic action of arginase infusions[j]. transplantation，1995，59(11)：1542-1546.
)ide dismutase (sod)， malondialdehyde (mda)， nitric oxide synthase (nos)， nitric oxide (no) and atpase. results i/r increased intrahepatic shunting fraction， mda in liver， decreased sod in liver. l-arg decreased intrahepatic shunting fraction， mda in liver， and increased sod in liver. conclusion the possible protective mechanism of l-arg can ameliorate cirrhotic liver， i/r injury may be contributed to decreasing ihsf， increasing fhbf and improving cell metabolizes by increasing no.
