作者：覃淑云 蔡科军 冯照善 张庆金 韦启后
【摘要】 目的 观察研究去卵巢sd大鼠前后颅骨组织中il-10的表达水平，探讨绝经后il-10对骨质疏松影响的机制。方法 sd雌性大鼠随机分为正常对照组和去卵巢（ovx）后第5周组、第7周组；双能x线吸收法测定骨密度（bmd）；取颅骨采用免疫组织化学abc法及图像分析技术观察颅骨组织中il-10表达变化。结果 ovx组与对照组比较bmd明显下降；il-10在骨小梁和骨髓的分布类似，il-10分布在骨小梁周边成骨细胞中，骨髓基质细胞也成阳性染色，成骨细胞染色要浅于基质细胞。去势组骨小梁周边阳性成骨细胞要明显少于对照组，并且染色较对照组浅。结论 去势引起骨组织il-10表达下降，il-10在骨质疏松发病机制中起着重要作用。
【关键词】 卵巢切除 大鼠 il-10 免疫组织化学
骨质疏松是一种常见的全身性骨骼疾病，主要表现为骨密度降低和骨骼脆性增加，从而导致了骨折增加的风险。wwW.11665.Com绝经后骨质疏松的发病机制目前仍未清楚，目前研究发现il-1、il-2、il-6、il-8、il-10、tnf等一系列的细胞因子在绝经后妇女骨质疏松患者与非骨质疏松者体内的含量是不同的，细胞因子通过自分泌与旁分泌的方式参与调控骨的吸收与形成，但哪一个细胞因子是主要的调控因子目前尚未明确，目前多数研究集中在il-1、il-6和tnf上，而对绝经后骨质疏松后局部骨组织中的il-10的表达研究不多，我们用雌性大鼠去势后建立绝经后骨质疏松动物模型，用免疫组织化学法及图像分析观察骨组织中il-10表达的变化，探讨绝经后il-10对骨质疏松影响的机制。
1.材料与方法
1.1动物分组与处理
选用40只sd雌性大鼠，15周龄，体重(205±15)ｇ，随机分为去势组和对照组，其中去势组又分为第5周和第7周两个时间组，每组20只sd大鼠。去势组大鼠均用1%戊巴比妥钠腹腔内麻醉(30mg/kg)，下腹部切口，去势组行双侧卵巢切除术，而对照组仅行开腹术。各组大鼠分笼饲养，标准大鼠饲料，自由进水、进食。
1.2 标本采集与制备
各组处死后取大鼠颅骨标本，一部分用10%福尔马林固定，24ｈ后复合酸脱钙3d梯度乙醇脱水、透明、石蜡包埋、切片(厚度约5um)。
1.3 骨密度（bmd）测定
各组大鼠处死前称体质量,2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉,采用双能x线骨密度仪提供的小动物全身骨密度测定软件,进行全身骨密度测定, 将目标区的面积设定为0.05cm2，每个目标骨取3个点进行测量，每个标本进行3次扫描记录其平均值。
1.4 免疫组织化学染色及观察
采用abc法进行免疫组织化学染色，切片经梯度乙醇处理，正常血清封闭后，加入鼠抗人il-10多克隆抗体（上海西唐生物科技有限公司），工作浓度1：50，4℃过夜,pbs洗后加生物素标记兔抗鼠igg(1:500)37℃,经abc复合物37℃处理。40min后用pbs洗,在过氧化氢液和dab的显色液中显色,系列乙醇脱水、二甲苯透明、树脂封片、光镜下观察。每次均设阴性对照，用pbs代替一抗孵育做空白对照，结果为阴性。
1.5 图像分析
标本结果采用imagepro plus5.0图像分析软件，测定骨小梁阳性细胞染色灰度值，每张切片随机选取5个高倍视野（x400），取其平均值作为该标本阳性细胞灰度值。
1.6 统计学分析
采用spss 15.0统计软件包进行分析。计量数据以均数±标准差表示，t检验用于组间差异比较，p<0.05为显著性水平。
2. 结果
2.1 各组大鼠骨密度检测结果见表1。
表1 对照组与去卵巢组大鼠bmd检测结果
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2.2 il-10免疫组织化学结果
免疫组织化学观察il-10在骨小梁和骨髓的分布类似，il-10主要分布在骨小梁周边成骨细胞中，骨髓基质细胞也成阳性染色，成骨细胞染色要浅于基质细胞。去势组骨小梁周边阳性成骨细胞要明显少于对照组，并且染色较对照组浅，去势组第5周和第7周结果相似，结果见表2。
表2 il-10阳性细胞灰度值
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3. 讨论
本实验结果显示去卵巢大鼠第5周组和第7周组骨密度(bmd)明显小于对照组，说明去势第5周即可出现明显骨质疏松，去卵巢大鼠的绝经后骨质疏松症模型已经形成。
有报道，骨质疏松是一种骨组织微环境恶化，矿物质流失的全身性骨骼疾病，最终的结果就是骨质脆化导致骨折的发生[1]。有两种细胞在这一过程中起到了关键作用，一种是成骨细胞（obs），成骨细胞的作用是构建骨质，由间充质细胞分化而来，间充质细胞可以分化成骨髓基质细胞或者是脂肪细胞，成熟的成骨细胞持续不断地使基质矿物质沉积并开始骨化。另一种是破骨细胞（ocs），破骨细胞的作用是重吸收骨质，来源于髓系前体细胞，髓系前体细胞产生巨噬细胞和树突状细胞，破骨细胞是唯一一种能破环骨质、牙质以及钙化的软骨的多核细胞[2、3、4]。nf-κb和巨噬细胞集落刺激因子（m-csf）是多核破骨细胞形成和融合的关键因素[5、6]，这两个因子维持了骨骼的完成和钙代谢的平衡。问题是当骨的重吸收率大于骨的矿物质沉积率时，这种平衡就会打破，最终导致骨质流失变成骨质疏松。只有抑制破骨细胞对骨质的重吸收这一办法才能维持这种平衡。
虽然感染、炎症和自身免疫疾病被广泛认为与骨质流失有关，但最近研究已经证明t淋巴细胞以及它所产生的细胞因子才是骨重塑的关键调节因素[7]。在这一领域中关于分子机制的众多研究已经表明各种细胞因子和信号转导蛋白参与了t淋巴细胞和骨细胞之间相互影响的调节[8]。而且，除了t淋巴细胞和骨细胞有共同的信号分子外，它们都来源于骨髓，它们不仅在成熟和活化后相互影响，而且在它们的初始阶段就已经开始互相影响了，例如，t细胞通过各种细胞因子，如il-1、il-4、il-6、inf-γ等来启动破骨细胞基因[9]。我们回顾有关骨质疏松发生的直接和间接机制研究将会发现在众多的发病机制研究中有一个关键的机制，那就是活化的t细胞会诱导破骨细胞基因因子的产生。活化的t细胞会破环骨代谢平衡，并且在缺乏雌激素这种病理状态下引起骨组织破坏[10]。
本实验用免疫组织化学染色方法发现il-10主要分布在骨小梁周边成骨细胞中，骨髓基质细胞也成阳性染色，成骨细胞染色要浅于基质细胞，去势组骨小梁周边阳性破骨细胞要明显少于对照组。
il-10是一种对抗炎强有力的th2 细胞因子，它可以由多种细胞产生，比如th2 细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞。il-10的作用是抑制巨噬细胞或单核细胞和t淋巴细胞的复制，以及一些炎症细胞因子的产生，包括il-1、il-6、il-8、il-12、tnf-α等[11]。il-10会下调mhc-i和mhc-ii分子的表达以及th1 细胞因子的产生，与此同时，它促进b细胞的活化, 通过抑制细胞凋亡来调节免疫球蛋白的转换和维持b细胞的活性。il-10调节了细胞和激素的免疫应答，因此il-10显著影响着几种疾病。
绝经后骨质疏松症是由体内雌激素下降引起的，本实验观察发现雌激素下降后模型组骨松质中il-10的含量减少，说明il-10在绝经后骨质疏松的发病机制中产生着重要作用。
参 考 文 献
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