【摘要】  　　目的: 构建大鼠il-10基因的真核表达载体, 观察其在大鼠肝细胞系brl中的表达, 比较有无受体介导的脂质体的转染效率。方法: 抽提外周血单个核细胞的总rna, 通过rt-巢式pcr方法获得大鼠il-10的全长编码序列, 定向克隆到真核表达载体pcdna3.0, 并进行限制性内切酶酶切及测序鉴定。将重组质粒分别通过脂质体transfasttm与去唾液酸糖蛋白受体介导的脂质体peijet-gal转入大鼠肝细胞系brl, 通过rt-pcr方法检测il-10 mrna的表达, 比较二者的转染效率, 用elisa法检测后者分泌型il-10的表达。结果: 经酶切及测序鉴定证实, 重组质粒插入片段与大鼠il-10的全长编码序列完全相符。发现受体介导的脂质体peijet-gal转染效率明显高于非受体介导的脂质体transfasttm 。通过受体介导的脂质体转染, brl细胞获得高水平的il-10表达。结论: 成功地构建pcdna3.0-il-10重组质粒。受体介导的脂质体对肝细胞有较高的转染活性, 可能成为il-10基因治疗肝纤维化的有效转染载体。

【关键词】  白细胞介素-10 基因治疗 去唾液酸糖蛋白受体 肝细胞

　　construction of eukaryotic expression plasmid containing rat interleukin-10 gene and its expression in brl cells in vitro

　　chen yun-xin, huang yue-hong, chen zhi-xin, zheng wei-da, wang xiao-zhong*

　　department of gastroenterology, union hospital, fujian medical university, fuzhou 350001, china

　　［abstract］  aim: to construct eukaryotic expression vector of rat il-10 gene and observe its expression in hepatocyte cell line brl. methods: total rna was extracted from rat peripheral blood mononuclear cells. the full length coding region of il-10 was amplified by rt- nested pcr and cloned into eukaryotic expression vector pcdna3.0. the recombinant plasmid was transfected into brl cells with either liposome transfasttm or asialoglycoprotein receptor mediated liposome peijet-gal respectively. the expression of il-10 mrna was detected with pcr and that of il-10 secreted from brl cells transfected by liposome peijet-gal was detected with elisa. results: the recombinant plasmid was identified and confirmed with digestion of restriction endonuclease and dna sequencing. receptor mediated liposome peijet-gal exhibited significantly higher transfection efficiency than liposome transfasttm and higher level secretory il-10 expressed in brl cells. conclusion: the eukaryotic expression vector of il-10 gene was successfully constructed. asialoglycoprotein receptor-mediated liposome had high transfection efficiency on hepatocytes, suggesting that it could be a potential hepatocyte-targeting delivery system for il-10 gene therepy.

　　［keywords］interleukin-10; gene therapy; asialoglycoprotein receptor; hepatocyte

　　肝纤维化是多种慢性肝病发展为肝硬化的共同病理过程。wwW.11665.COm白细胞介素-10（il-10）是一种具多效性的细胞因子, 在肝纤维化的进程中扮演重要的负反馈角色［1］。引入外源性il-10也被证实对肝纤维化有拮抗作用［2］。但是由于重组il-10半衰期很短,   难以在体内维持一个相对稳定的浓度; 静脉用药, 其作用缺乏肝脏靶向性。而探讨通过合适途径进行il-10的基因治疗, 则有可能解决上述问题, 具有一定的应用前景。本实验中构建大鼠il-10基因的真核表达载体, 并通过受体介导的脂质体和非受体介导的脂质体转染大鼠肝细胞系brl, 观察il-10的表达情况, 比较2种有无受体介导的脂质体的转染效率, 为下一步il-10基因治疗肝纤维化的动物实验奠定了基础。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  真核表达载体pcdna3.0由福建省消化研究室保存; 逆转录酶购自fermentas公司; 高保真taq酶、 限制性内切酶hind ⅲ、 bamhⅰ及t4连接酶均购自promega公司; 质粒抽提试剂盒购自qiagen公司; 胶回收试剂盒购自上海中科开瑞生物芯片科技有限公司; peijet-gal转染载体购自polyplus公司; transfasttm脂质体购自promega公司, rna抽提试剂盒购自gentra公司; 大鼠il-10 elisa试剂盒购自biosource公司; brl是永生化的正常大鼠肝细胞系引自中国科学院上海细胞库。

　　1.2  方法

　　1.2.1  大鼠il-10基因的获取  取sd大鼠外周血5 ml, 以ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞, 用rna抽提试剂盒按说明书抽提总rna, 并逆转录为cdna作为模板, 设计两对引物, 用巢式pcr方法扩增出il-10的全长编码序列（包括信号肽与功能肽）。外侧引物分别位于il-10编码序列两端的外侧, 其扩增产物将作为内侧引物的模板; 而内侧引物恰位于编码序列两端, 并引入hind ⅲ和bamh ⅰ酶切位点和kozak序列。外侧引物序列: 上游5′-cgcagccttgcagaaaacagagc-3′, 下游5′-gctctatttatgtcctgcagtccag-3′, 产物片段为606 bp; 内侧引物序列: 上游5′-cgaagcttgccaccatgcttggctcagcac-3′, 下游5′-cgtctagatcaatttttcattttgagtg-3′, 产物片段为559 bp。后者扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳, 切下目的片段, 用胶回收试剂盒提取目的dna。

　　1.2.2  il-10-pcdna3.0重组质粒的构建与鉴定  上述目的片段与pcdna3.0空质粒均用hind ⅲ和bamhⅰ酶进行双酶切,酶切条件为: 总体系20 μl, 含10×酶切缓冲液2 μl, bsa 2 μg, dna 1 μg, hind ⅲ 5 u, bamhⅰ 5 u, 37℃ 4 h。酶切产物各自在琼脂糖凝胶上电泳, 用胶回收试剂盒提取较长片段。目的基因和质粒的回收片段按浓度比3∶1混合, 加入t4连接酶, 4℃过夜。以连接产物转化感受态大肠杆菌dh5α, 并接种于氨苄青霉素阳性培养液。24 h后用接种针挑取部分菌落作为模板, 用il-10内侧引物进行菌落pcr, 对扩增出il-10的菌落之一进行增菌培养, 用质粒回收试剂盒按说明书抽提质粒, 用hind ⅲ和bamhⅰ双酶切, 在琼脂糖凝胶上电泳鉴定。并将重组质粒送测序鉴定（委托invitrogen公司进行）。

　　1.2.3  peijet-gal脂质体与transfasttm脂质体对brl细胞转染效率的比较  转染前24 h调整细胞数, 将brl细胞接种于6孔板中, 使转染时细胞铺满孔底的50%~60%。分别用 peijet-gal脂质体与transfasttm脂质体将重组质粒转染brl细胞24 h, 并于转染结束即时及之后1、 2、 4、 8、 12、 16 d用rna抽提试剂盒抽提各组细胞的总rna, 用rt-pcr方法检测il-10的mrna表达, 设立β-actin为内参照, il-10引物为上述的内侧引物, β-actin引物序列: 上游5′-ccaaccgtgaaaagatgacc-3′, 下游5′-caggaggagcaatgatcttg-3′, 产物片段为660 bp。扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳, 凝胶成像系统下观察。

　　1.2.4  重组质粒转染brl细胞及分泌型il-10的表达  转染前24 h调整细胞数, 将brl细胞接种于6孔板中, 使转染时细胞铺满孔底的50%~60%, 更换2 ml含有100 ml/l小牛血清的dmem培养液备用。按peijet-gal转染体系说明书, 将重组质粒和pcdna3.0空质粒分别转染brl细胞, 每组3孔, 24 h后弃上清, 换2 ml含有100 ml/l小牛血清的dmem培养液。之后每24 h收集上清, 并换2 ml新鲜培养液。取转染后1、 2、 4、 8、 12、 16、 20、 24 d的上清, 用ratil-10 elisa试剂盒检测上清中il-10的含量, 并绘制表达曲线。

　　2  结果

　　2.1  大鼠il-10基因的获取  以il-10外侧引物扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳, 未见明显片段。但以此扩增产物为模板, 用il-10内侧引物进行扩增, 并在琼脂糖凝胶上电泳, 在紫外透射仪下见大约559 bp处出现一dna片段。

　　2.2  il-10-pcdna3.0重组质粒的构建与鉴定  重组质粒用hind ⅲ和bamhⅰ双酶切后, 产物进行琼脂糖凝胶电泳, 显示有1条与目的基因mr一致的dna片段（图1）。测序结果在blast上比对显示, 插入片段序列与大鼠il-10的编码序列完全一致。

　　图1  重组质粒pcdna3.0-il-10的酶切鉴定（略）

　　fig 1  restriction endonuclease digestion analysis of the recombinant plasmid pcdna3.0-il-10

　　1: pcdna3.0-il-10-plasmid digested by hind ⅲ/bamh ⅰ; m1: 100 bp dna marker; m2: λ-hind ⅲ dna marker; 2: pcdna3.0-il-10 plasmid.

　　2.3  peijet-gal脂质体与transfasttm脂质体转染效率的比较  transfasttm脂质体组il-10 mrna表达较低, 在转染后2 d达到高峰（表达量仍低于β-actin）, 而后迅速下降, 第8天表达消失。而peijet-gal脂质体组il-10 mrna表达明显高于β-actin, 在转染结束即达高峰, 持续高水平表达至16 d后才开始下降, 到转染后20 d仍有较高表达（图2）。

　　图2  使用不同脂质体转染后brl细胞中il-10 mrna的表达（略）

　　fig 2  expression of il-10 mrna in brl cells transfected by different liposome

　　a: transfect by liposome transfasttm; b: transfect by liposome peijet-gal; m: dna markers; 0, 1, 2, 4-16: 0, 1, 2, 4-16 days post transfection.

　　2.4  重组质粒转染后分泌型il-10的表达  转染pcdna3.0空质粒者几乎测不到il-10的表达; 转染重组质粒者可检测到高浓度的分泌型il-10的表达, 在转染结束后第2天达到高峰（12.78 μg/l）, 第4天即迅速下降, 第8天后保持长时间的低水平表达, 其表达曲线见（图3）。

　　图3  分泌型il-10的表达（略）

　　fig 3  expression of secretory il-10

　　3  讨论
   
　　il-10是肝纤维化的重要拮抗因子。但是, il-10在体内r半衰期仅数小时, 为了维持血药浓度, 需多次注射, 且费用昂贵。另外, 静脉注射il-10作用缺乏靶向性。如果能将il-10基因转移到合适的靶细胞内, 使其在肝脏较稳定的表达, 就可能解决上述问题。
   
　　肝纤维化的形成机制十分复杂, 有多种细胞参与其中, 除了起决定性作用的肝星状细胞（hsc）外, 还有肝细胞、 kupffer细胞、 窦内皮细胞等［3］。我们认为肝细胞作为基因转移的靶细胞较为合适,基于以下几点考虑: (1)肝脏中, 肝细胞在数量上占绝对优势, 将其作为靶细胞, 可以保证目的基因在肝脏中的高表达; (2)肝细胞膜表面有一种特异性的去唾液酸糖蛋白受体, 为提高基因转移的靶向性提供可能［4, 5］; (3)肝细胞在解剖上与hsc毗邻, 在后者的激活与肝纤维化的进程中起着举足轻重的作用; (4)本实验室以往的研究显示,  il-10对肝纤维化动物模型及在体的hsc作用非常显著, 而单纯将il-10直接作用于体外培养的hsc, 却影响甚微［6-8］。这提示il-10对hsc的作用是一个多细胞、 多因子参与的过程, 而肝细胞可能在其中扮演重要角色。
   
　　基因治疗中, 载体和转染途径的选择至关重要。病毒载体普遍存在生物安全性问题; 另外, 目前比较常用的腺病毒载体虽然转染效率高, 但会引起强烈的免疫反应, 大大降低再次转染的效率。脂质体作为载体不存在上述问题, 但转染效率低。肝细胞膜上有高密度的去唾液酸糖蛋白受体, 可与半乳糖特异性结合。目前, 许多研究利用这一特性, 进行肝靶向药物递送或基因递送, 取得了很好的效果［9, 10］。jetpeitm-gal转染体系是在阳离子脂质体上结合半乳糖, 使对肝细胞的靶向性和转染效率都大大提高。
   
　　我们通过巢式pcr方法扩增了在体内微量表达的il-10基因, 成功构建了pcdna3.0-il-10重组质粒, 并转染体外培养的大鼠肝细胞系brl, 获得了高水平的分泌型il-10的表达。同时发现受体介导的脂质体可大大提高对肝细胞的转染效率, 延长il-10基因的表达时间。为今后的动物体内实验奠定了基础。另外, 还发现转染后第4天开始出现il-10 mrna与蛋白表达的分离现象, 提示在后期存在翻译水平的抑制。这种抑制是否由于后期体外培养的细胞密度过高所致, 尚不得而知。动物体内实验是否也会出现这种分离现象, 有待进一步研究。

【参考文献】
  　　［1］ louis h, van laethem jl, wu w, et al. interleukin-10 controls neutrophilic infiltration, hepatocyte proliferation, and liver fibrosis induced by carbon tetrachloride in mice［j］. hepatology, 1998, 28(6): 1607-1615.

　　［2］ nelson dr, lauwers gy, lau jy, et al. il-10 treatment reduces fibrosis in patients with chronic hepatitis c: a pilot trial of interferon nonresponders［j］. gastroenterology, 2000, 118(4): 655-660.

　　［3］ friedman sl. cytokins and fibrogenesis［j］. semin liver dis, 1999, 19(2): 129-140.

　　［4］ mani sa, harish s, vathsala pg, et al. receptor-mediated gene delivery approach demonstrates the role of 5′-proximal dna region in conferring phenobarbitone responsiveness to cyp2b2 gene in rat liver in vivo［j］. biochem biophys res commun, 2000, 268(3): 734-739.

　　［5］ 王炜煜, 易继林, 邓云华, 等. 去唾液酸糖蛋白受体特异性单链抗体的优化表达及亲和常数的测定［j］. 细胞与分子免疫学杂志, 2006, 22(4): 504-506.

　　［6］ wang xz, zhang lj, li d, et al. effects of transmitters and interleukin-10 on rat hepatic fibrosis induced by ccl4［j］. world j gastroenterol, 2003, 9(3): 539-543.

　　［7］ zhang lj, zheng wd, shi mn, et al. effects of interleukin-10 on activation and apoptosis of hepatic stellate cells in fibrotic rat liver［j］. world j gastroenterol, 2006, 12(12): 1918-1923.

　　［8］ 陈运新, 王小众, 翁山耕, 等. 白细胞介素10对肝星状细胞增殖及表达fas/fas配体的影响［j］. 中华肝脏病杂志, 2003, 11(6): 637-640.

　　［9］ di stefano g, derenzini m , kratz f, et al. liver-targeted doxorubicin: effects on rat regenerating hepatocytes［j］. liver int, 2004, 24(3): 246-252.