人血高密度脂蛋白对内毒素血症急性肝衰竭小鼠的防护作用
【关键词】 脂蛋白类；内毒素；肝衰竭，细胞因子
【摘要】 目的：研究高密度脂蛋白(hdl)抗内毒素，保护肝细胞作用. 方法：用超离心方法分离纯化血浆脂蛋白，建立内毒素血症急性肝衰竭小鼠模型，观察hdl处理后各组肝衰竭小鼠的存活率及主要脏器的组织学改变，rtpcr检测小鼠肝细胞tnfα和il6 mrna表达水平. 结果：hdl对内毒素及半乳糖胺所致小鼠肝衰竭有明显保护作用，治疗组存活率明显高于对照组(85％ vs 15%)；内毒素血症肝衰竭小鼠肝脏发生了广泛的变性坏死，而hdl治疗组小鼠肝细胞仅发生了轻微变性坏死，单纯无脂蛋白血浆(lff)则无此保护作用；内毒素小鼠肝组织tnfα和il6 mrna表达水平增高，hdl治疗组tnfα和il6 mrna表达水平接近正常. 结论：hdl具有抗内毒素血症保护小鼠肝细胞，预防肝衰竭的作用. 其作用机制可能是通过降低肝衰竭小鼠tnfα和il6的过度表达而发挥作的.
【关键词】 脂蛋白类；内毒素；肝衰竭，细胞因子
0引言
高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein, hdl)颗粒小,蛋白质含量高，主要为apoaⅰ，levels等［1］报道hdl可以介导细菌内毒素清除和脱毒. 内毒素血症与肝损害互为因果，在重型肝炎发病中具有重要作用. 但至今临床上尚无真正的抗内毒素药物. 我们用人血浆纯化hdl治疗急性肝功能衰竭小鼠内毒素血症， 观察其对肝脏的保护作用， 并进一步研究其机制.
1材料和方法
1.1材料
正常人新鲜血浆200 ml，密度梯度离心（日立cp100mx型超速离心机）收集密度在1.063～1.21 g/cm3的hdl部分，透析浓缩后考马斯亮蓝测定蛋白含量. 另外取最底层无脂蛋白血浆部分（lff，d＞1.21）透析浓缩. hdl纯度鉴定采用sds聚丙烯酰胺凝胶电泳法 分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为6%，血浆超离心各种脂蛋白层各取25 μl加sds制备样品，点样，恒流20 ma，样品进入分离胶后恒流30 ma，电泳3 h 30 min.
1.2方法
babl/c小鼠（购于中国科学院上海实验动物中心）60只，体质量(18±2) g，随机分为3组，每组20只，雌雄各半，每只小鼠ip内毒素lps（来自大肠杆菌血清型o55∶b5，sigma） 15 mg/kg和半乳糖胺（galn, sigma） 500 mg/kg混合液（总体积500 μl）. 治疗组分别于造模前0.5 h及造模后1，2，4 h尾静脉iv hdl+lff（37℃预培育3 h）注射剂量hdl 40 mg/kg，lff 5 ml/kg；lff对照组注射lff 5ml/kg；生理盐水对照组注射等量生理盐水. 连续72 h观察小鼠存活情况. 取小鼠适量肝、脾、肾、肺、心、脑组织用40 g/l的甲醛溶液固定，石蜡包埋，常规切片，he染色. 另剪取新鲜瘤组织50 mg，加trizo1（gibco公司） 1 ml，充分匀浆后按照说明书步骤提取总rna，以其为模板严格按反转录试剂盒（promega）说明书逆转录合成cdna后， pcr扩增体系参照文献［2］，以βactin为内参照. pcr产物经琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析仪（geldocl1000型）分析，所用引物是根据基因库中小鼠cdna序列应用oligo软件自行设计，由上海生物工程公司合成（表1）.表1pcr扩增的引物序列、片段长度、退火温度及循环数
统计学处理：采用χ2检验. p<0.05认为有统计学意义.
2结果
sdspage显示各种脂蛋白（vldl，ldl，hdl）分离完全，表明采用超速离心法从人血浆纯化hdl的纯度和特异性均好.
2.1hdl对小鼠肝衰竭的保护作用
hdl+lff具有显著抗内毒素及半乳糖胺致死作用，而单纯lff抗致死作用不明显. 各组小鼠死亡率分别为：模型组为85%，lff对照组为80%，hdl治疗组15%（χ2=13.65，p<0.001）. 模型组小鼠肝细胞混浊肿胀，大量肝细胞坏死，肝窦及汇管区炎细胞浸润，心、脑、肺、脾、肾组织学未见明显异常. lff对照组病理改变与模型组类似. 而hdl治疗组小鼠肝细胞仅见肝细胞混浊肿胀等变性和轻微坏死（图1）.a: 模型组; b: lff对照组; c: hdl治疗.
2.2hdl对肝衰竭小鼠肝细胞因子的影响
模型组肝组织tnfα和il6 mrna表达水平增高，lff对照组与模型组无差异，hdl治疗组tnfα和il6 mrna表达水平接近正常小鼠（图2）.
3讨论
内毒素含脂质a，脂蛋白是体内脂质运载的工具，因此，脂蛋白可以结合内毒素，是天然存在的细胞外lps清除剂. 本研究显示hdl能显著降低内毒素所致肝功能衰竭小鼠的死亡率. 模型组小鼠肝脏发生广泛变性坏死，肾、脾、心、脑组织未见类似改变，与文献报道用半乳糖胺敏化内毒素选择性诱导小鼠肝功能衰竭相一致［3］，lff对照组小鼠肝脏组织学改变与模型组相似，hdl+lff治疗组小鼠肝脏仅见轻微变性坏死；dna片断化分析模型组小鼠肝细胞dna呈现凋亡特征性梯状条带，而hdl治疗组则无此改变，说明肝细胞凋亡也是内毒素所致肝功能衰竭的一种重要病理形式. johnston等［4］研究表明，c57bｌ/6小鼠吸入lps能够诱导肺组织产生强烈的中性粒细胞反应，使tnfα，il1β，il6，ifn，mip1等mrna表达水平上升, 本研究亦显示iplps也能够诱导肝脏高表达tnfα和il6，表明这些炎性细胞因子在急性肝衰竭的发生发展中起重要作用. hdl治疗组tnfα和il6表达水平下降，可能与hdl结合血液中的内毒素，减轻肝细胞的炎症反应，起到保护肝脏的作用有关.
hdl起作用需要无脂蛋白血浆中某些成分参与. van leeuwen等［5］报道血浆中存在一种lbp（lpsbinding protein）,促进lps与hdl结合. 在正常情况下lps与hdl结合在一起，但超离心制备hdl时，在较强外力的作用下lbp从hdl中分离出来，分布到d＞1.21个g/cm3部分［6］. 在我们实验中用超离心法制备hdl，使lbp解离而丧失结合lps的作用，因此，在实验中加入lff后可使hdl恢复结合lps的能力，发挥保护肝细胞的作用. 本实验证实了血浆中的hdl是结合lps的主要成分，介导了lps清除和脱毒，其确切机制有待进一步研究.
【参考文献】
［1］levels jh, abraham pr, van den ende a, et al. distribution and kinetics of lipoproteinbound endotoxin［j］. infect immun, 2001, 69(5): 2821.
［2］chen yz, gu xf, caen jp, et al. interleukin3 is an autocrine growth factor of human megakaryoblasts, the dami and meg 01 cells［j］. br j haematol, 1994,88(3): 481-487.
［3］leist m, gantner f, bohlinger i, et al. tumor necrosis factorinduced hepatosis precedes liver failure in experimental murine shock models［j］. am j pathol, 1995, 146(5): 1220-1234.
［4］johnston cj, finkelstein jn, gelein r, et al. pulmonary cytokine and chemokine mrna levels after inhalation of lipopolysaccharide in c57bl/6 mice［j］. toxicol sci, 1998, 46(2): 300-307.
［5］van leeuwen hj，van beek ap，dallingathie gm，et al.the role of high density lipoprotein in sepsis［j］. nertherlands j med, 2001, 59(3):102-110.
［6］wurfel mm, kunitake st, lichenstein h, et al. lipopolysaccharide (lps)binding protein is carried on lipoproteins and actss as a cofactor in the neutralization of lps［j］. j exp med,1994,180(3):1025-1035.
