as2o3对人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤的抗肿瘤作用
【关键词】 三氧化二砷；宫颈肿瘤；异种移植模型抗肿瘤试验
【摘要】 目的 探讨不同剂量三氧化二砷（as2o3）对人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤的抗肿瘤作用及机制。方法将4×106个hela细胞接种于裸鼠皮下，建立人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤模型，随机分为as2o3低剂量（1.0 mg/kg）、中剂量（2.5 mg/kg）、高剂量（5.0 mg/kg）组及生理盐水空白对照组、顺铂阳性对照组，腹腔连续给药10 d，停药后24 h处死裸鼠留取标本计算抑瘤率，流式细胞仪检测细胞凋亡率， rtpcr方法检测移植瘤组织caspase3基因的相对表达量，免疫组化sp法检测磷酸化细胞外信号调节激酶（perk）的表达。结果 各剂量as2o3组及顺铂组瘤质量与生理盐水组相比均有统计学意义（f=39.14，p<0.05）；as2o3高、中、低剂量组流式细胞仪检测时均出现典型凋亡峰，凋亡率分别为17.89％、17.19％、18.52％；as2o3作用后caspase3基因的表达较生理盐水组明显升高，差异均有统计学意义（f=8.76,q=3.06～5.81,p＜0.05）；as2o3各剂量组perk的表达较生理盐水组降低。结论 as2o3 对人宫颈癌移植瘤的生长具有明显的抑制作用，其机制与上调caspase3基因的表达诱导细胞凋亡，下调perk的表达与抑制mapk信号传导通路有关。Www.11665.Com
【关键词】 三氧化二砷；宫颈肿瘤；异种移植模型抗肿瘤试验
antitumor effect of arsenic trioxide on subcutaneously transplanted human cervical carcinoma in nude mice
sun yingzhao, zhao yuanyuan, he xinjia, et al
(department of oncology, the affiliated hospital of qingdao university medical college, qingdao 266003, china);
［abstract］ objective to study the antitumor effect of arsenic trioxide with different concentrations on subcutaneously transplanted human cervical carcinoma (hcc) cell (hela cell line) in nude mice and their action and mechanism. methods a tumor model of human hcc was created by subcutaneous inoculation of 4×106 hela cells into nude mice. the mice were randomized to low (1.0 mg/kg)，medium (2.5 mg/kg)，and highdose arsenic trioxide (5.0 mg/kg) group, saline group and ddp group. the mice in each group received intraperitoneal injection of the drug for 10 days, and were sacrificed 24 hours after the last injection and tissue specimen was obtained. tumor inhibition rate was calculated, the apoptosis rate detected with flow cytometry, the relative expression of caspase3 gene was determined with rtpcr. immunohistochemistry sp method was adopted to detect the expression of phosphorylated extracellular signalregulated kinase (perk). results compared with saline group, the mice in arsenic trioxide groups and ddp group showed significant inhibition in the growth of the transplanted tumor (f=39.14,p<0.05). the apoptotic peak was observed in all three arsenic groups with the apoptosis rates being 17.89％, 17.19％ and 18.52％ for the high, medium and lowdose groups, respectively. the expression of caspase3 in arsenic groups was significantly higher than that of the saline group (f=8.76,q=3.06-5.81,p＜0.05), while the expression of perk was lower. conclusion arsenic trioxide showed obvious inhibition on the growth of transplanted hcc cells. the inhibitory action is related to the upregulation of caspase3 expression which induces apoptosis, downregulation of perk expression and inhibition of mapk signal transducting system.
［key words］ arsenic trioxide； cervix neoplasms; xenograftmodel antineoplastic test
宫颈癌是女性第二位常见肿瘤疾病，严重威胁女性的生命，已引起人们的广泛关注。三氧化二砷（as2o3）成功治疗急性早幼粒细胞白血病为肿瘤治疗开辟了一个新的方向[12]。目前国内外研究发现，as2o3在细胞水平可通过诱导细胞凋亡、影响信号传导通路等多途径抑制宫颈癌细胞的生长，但体内水平研究鲜有报道[34]。本实验通过建立人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤模型，对as2o3的体内抗肿瘤作用及机制进行研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株和实验动物
人宫颈癌细胞株hela由青岛大学医学院微生物学研究室惠赠；balb／cnu裸鼠40只，4～6周龄，雌性，体质量18～22 g，购自苏州贝尔达生物医药科技有限公司，spf级动物实验室饲养。
1.1.2 药物及试剂
as2o3注射液系哈尔滨伊尔达药业有限公司惠赠，顺铂注射液购自江苏豪森药业股份有限公司；b.d.vantage型流式细胞仪购自美国；多克隆活性caspase3抗体购自bd公司，引物及荧光探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，trizol试剂盒购自invitrogen公司，rtpcr 反应试剂盒购自日本takara公司，磷酸化细胞外信号调节激酶（perk）抗体(sc7383)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。齐鲁医学杂志2010年8月第25卷第4期 med j qilu, august 2010, vol.25, no.4
1.2 方法
1.2.1 细胞培养和动物模型的建立
宫颈癌细胞株hela培养于含体积分数0.10标准胎牛血清的rpmi1640培养液中，在37 ℃、体积分数0.05 co2条件下培养，收集对数生长期的细胞并制备成密度为3×1010 ／l的单细胞悬液，在超净工作台内于裸鼠腋窝皮下注射0.2 ml的单细胞悬液,7 d后所有裸鼠均出现直径大于5 mm 的皮下结节，移植瘤模型建立。
1.2.2 裸鼠分组、给药
接种后第8天将已建立皮下移植瘤模型的40只裸鼠随机分为5组，即as2o3低、中、高剂量组(剂量分别为1.0、2.5及5.0 mg／kg)，生理盐水（ns）空白对照组、顺铂（ddp，5 mg/kg）阳性对照组，每组8只。当日起将as2o3、顺铂注射液（稀释至适当浓度）及生理盐水各0.2 ml经腹腔注射，连续给药10 d。给药期间观察各组裸鼠的精神、反应、活动、饮食及大小便等一般情况。
1.2.3 标本采集
停药后第2天采用摘眼球取血法处死裸鼠，剥离瘤组织并称质量，将其分成3份，分别用于流式细胞仪、rtpcr及免疫组化检测。按下列公式计算抑瘤率：抑瘤率=（对照组瘤质量-实验组瘤质量/对照组瘤质量）×100％。
1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率
取保存于体积分数0.70冰乙醇中的瘤组织适量，置于200目不锈钢网筛上研磨并400目筛网过滤，制成单细胞悬液，室温避光染色30 min，在流式细胞仪上进行细胞凋亡率的检测，采用modfit ltv2.0软件系统分析结果。
1.2.5 rtpcr检测caspase3基因表达
按照rtpcr试剂盒说明书要求提取瘤组织中总rna，反转录合成cdna,然后采用taq探针法以管家基因gapdh为内参照,进行pcr反应，测定ct值。采用2-δδct法进行caspase3 基因表达的相对定量分析，其中ct值为荧光信号达到阈值时的循环数，δct为同一样本达到阈值时靶基因caspase3 与管家基因gapdh扩增所需的循环数差值，即δct=ct(caspase3)-ct(gapdh),△△ct值代表经gapdh校正后的靶mrna的数目。
1.2.6 免疫组化sp法测定perk表达
采用sp法进行免疫组织化学染色，具体步骤严格按照说明书进行。以胞核和(或)胞浆出现棕黄色或棕褐色颗粒者为阳性细胞。参照fromowitz等[5]的方法进行评分：细胞无着色为阴性(-)，淡黄色为弱阳性（+），棕黄色为阳性()，棕褐色为强阳性（）。每组实验均重复3次，测量结果取均值。
1.3 统计处理
采用spss 10.0及ppms 1.5[6]统计学软件进行处理，数据以±s表示，多组比较采用方差分析，组间两两比较采用studentnewmankewls 检验；计数资料比较采用秩和检验。
2 结果
2.1 as2o3抑瘤作用及诱导移植瘤的凋亡作用
用药后ns组及各剂量as2o3组裸鼠精神可，反应敏捷，活动如常，饮食可，大小便无明显异常；ddp组裸鼠渐出现精神萎靡不振、反应迟钝、活动减少、饮食量少、腹泻及消瘦等恶病质表现。各剂量as2o3及ddp均抑制移植瘤生长，瘤质量与ns组相比均有统计学意义(f=39.14,p<0.05)。流式细胞仪分析显示，各剂量as2o3组及ddp组均出现典型的亚g1期凋亡峰，各剂量as2o3组与ns组及ddp组相比差异均有显著意义（f=416.79,p<0.05）,不同剂量as2o3组凋亡率不同，以低剂量as2o3 组凋亡率最高。见表1。表1 as2o3对人宫颈癌裸鼠移植瘤的抑瘤及诱导凋亡作用（略）
2.2 移植瘤组织caspase3基因的表达
pcr扩增标准曲线测得目的基因（caspase3）及管家基因（gapdh）的曲线斜率分别为3.423、3.391，提示目的基因及管家基因在pcr反应时扩增效率近乎等同，可采用2-δδct法进行基因表达的相对定量分析。拟定ns组基因表达量为1，则得ddp组及低、中、高剂量as2o3组基因表达相对量。各剂量as2o3组caspase3基因的表达均高于ns组，差异有统计学意义（f=8.76,q=3.06～5.81,p<0.05），其中以低剂量as2o3组caspase3基因的表达最高。见表2。表2 宫颈癌裸鼠移植瘤caspase3基因表达相对定量分析（略）
2.3 perk的表达
各剂量as2o3组perk表达均低于ns组，差异有统计学意义（h=746.4，p<0.05）。见表3。表3 移植瘤内perk的表达测定（略）
3 讨论
宫颈癌是较常见的妇科肿瘤[7]，发病率及病死率呈上升趋势，严重威胁女性的生命。治疗是以手术为主联合化、放疗的综合治疗。目前的化疗药物有效率低，毒性大，有待新药的开发。体外研究发现，as2o3可诱导宫颈癌细胞凋亡，并呈现出一定的浓度和时间依赖性[34，8]。
本实验结果表明，as2o3有抑制肿瘤生长作用，各剂量as2o3组均出现典型的亚二倍体峰，它的出现被认为是细胞凋亡的重要标志，以低剂量as2o3组凋亡峰最明显，凋亡率最高，与ns组及ddp组相比均有统计学意义（p<0.05），提示as2o3在体内可通过诱导细胞凋亡而抑制肿瘤细胞生长，其诱导细胞凋亡的作用强于ddp，但与体外研究不同的是，as2o3诱导细胞凋亡的作用没有表现出剂量依赖性，低浓度as2o3诱导凋亡作用最强。细胞凋亡的分子生物学机制有待探讨，caspase3是否是其中一个靶点? caspase3是细胞凋亡的关键效应酶，kumar等[9]研究显示，caspase3在宫颈癌中表达下降，与宫颈癌发生发展密切相关。本研究结果显示，低剂量as2o3组caspase3基因表达相对最高，是ns组的1.54倍，中、高剂量组分别是ns组的1.27及1.15倍，揭示as2o3可以通过上调移植瘤内caspase3表达而诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤作用，并且上调的趋势与肿瘤的抑制作用效果相符。
细胞信号传导通路在肿瘤中的作用逐渐引起人们的关注，细胞外信号调节激酶（erk）[10]是丝裂原活化蛋白激酶（mapk）家族成员之一，该酶被激活（其活化形式是perk）后，在细胞生长、发育、分裂、死亡及恶性转化等过程中均发挥作用[1112]。本文实验结果显示，各剂量as2o3组perk表达均低于ns组及ddp组，提示as2o3通过抑制erkmapk信号传导通路而影响肿瘤生长。本实验同时观察了各组药物的不良反应，发现各剂量as2o3组裸鼠的精神状态、活动、饮食、大小便等一般状况未受到明显影响，各剂量as2o3组裸鼠体质量继续增加，提示as2o3未对裸鼠饮食、消化及吸收功能造成影响，即无明显胃肠道反应，并可能具有潜在的抗恶病质作用，与蔡洪培等［13］研究发现as2o3对腹腔荷瘤裸鼠具有抗恶病质效应的结果一致。可见as2o3毒性反应轻，是一种相对安全的药物，有望应用于宫颈癌的临床治疗。
综上所述，as2o3具有抑制人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤生长的作用，其作用机制与诱导宫颈癌细胞的凋亡有关，分子水平研究结果显示，as2o3可以上调 caspase3基因的表达而诱导细胞的凋亡；也可通过抑制erkmapk信号传导通路而发挥抗肿瘤作用；且as2o3不良反应小，是一种相对安全有效的药物，可以考虑宫颈癌的临床应用，并进一步探讨最适剂量。
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