【摘要】 目的观察pten与bcl2在鼻咽癌(npc)中的表达情况，探讨两者的表达及其联合表达在npc发生、发展、侵袭和转移过程中的可能作用。方法采用免疫组织化学染色法，观察50例npc 石蜡标本和15例正常鼻咽黏膜标本中pten与bcl2的蛋白表达情况。结果正常鼻咽组织中，pten呈强阳性表达，而bcl2的表达仅局限在上皮层的基底细胞层。npc中，pten阳性表达率为22.0%(11/50)，bcl2为82.0%(41/50)，与正常组比较，差异均有统计学意义。两者在npc的表达强度无明显相关(r=－0.109，p=0.453)。结论在npc组织中，pten的低表达或表达缺失和bcl2强阳性表达可能协同参与了npc的发生，而在npc的发展、浸润和转移过程中，两者未能表现出明显的相关性。
【关键词】 pten；滤泡型b细胞淋巴瘤/白血病2；鼻咽癌
expression and clinical significance of pten and bcl2 in nasopharyngeal carcinoma tissue
liu yangyun1, liu gengxun2,li zhengxian1,sun zhengliang1,zhou guanghua1,jiang wen1
1.department of otolaryngology, the second affiliated hospital of hu′nan normal university(no. 163 hospital of pla),changsha 410003, china ,2.department of pathology abstract：objective to investigate the expression and interrelationship of phospharase and tensill homolog deleted on chromosome ten(pten) and bcell lymphoma/leukemia2(bcl2) in npc. to evaluate their clinical implications in carcinogenesis, development, invasion and metastasis of npc.methodsthe expression of pten and bcl2 was examined in 50 poorly differentiated npc samples and 15 normal nasopharyngeal epithelium tissues using immunohistochemical staining (sp method).resultsin 15 normal nasopharyngeal epithelium samples pten was highly expressed but bcl2 protein expression was limited to the basal cell layer. the positive rates of pten and bcl2 protein expressions were 22%(11/50), 82%(41/50) in npc tissues, respectively. the differences between the npc and normal nasopharyngeal epithelium in both pten and bcl2 expressions were significantly observed according to the statistical analysis results . pten but not bcl2 expression was associated with t stage, lymph nodes metastases. there was no correlation between pten and bcl2 expressions in npc tissues.conclusionreduced or absent expression of pten and high expression of bcl2 were observed in npc tissues, which implied their mutual cooperative role to participate in tumor occurrence , progression and metastasis of npc.
key words：phospharase and tensill homolog deleted on chromosome ten(pten), bcell lymphoma/leukemia2(bcl2), nasopharyngeal carcinoma(npc)
1资料与方法
1.1标本来源收集解放军163中心医院2000年1月~2006年12月65例鼻咽活检石蜡标本，其中低分化鳞癌50例，均经病理证实。www.11665.com男女各25例，年龄16~78岁，中位年龄46岁。tnm分期采用2003年修改的国际抗癌联盟(uicc)和美国肿瘤联合会(ajcc)联合制定的tnm分期法分为t1:5例，t2:9例，t3:26例，t4:10例；有淋巴结转移者35例，无淋巴结转移者15例。所有病例活检前均未接受抗癌治疗。另取同期15例病理证实为慢性炎症的鼻咽黏膜标本作对照，男9例，女6例，年龄20~73岁，中位年龄47岁。
1.2主要试剂 pten、bcl2、即用型免疫组织化学超敏ultrasensitivetmsp试剂盒、酶底物显色剂dab kit(×20)、内源性生物素阻断试剂盒ihc biotin block kit、edta抗原修复缓冲液(×50) (ph8.0)均购自福州迈新生物技术有限公司，均为迈新即用型产品。
1.3方法
1.3.1免疫组化检测 pten和bcl2染色按sp染色试剂盒说明书操作。一抗工作浓度为1∶100。pten以喉癌组织作为阳性对照，bcl2以乳腺癌组织作为阳性对照，均以pbs代替一抗作阴性对照。
1.3.2结果判定标准 npc组织中，细胞胞质和胞核出现棕黄色颗粒状为pten阳性；细胞膜或核膜上出现黄色颗粒或斑片为bcl2阳性。参照文献资料[12]，结果评分采用双盲法，在光学显微镜下观察，随机取5个视野(×400)，计数每个视野下阳性细胞数，计算阳性细胞百分比（1）阳性细胞百分比：无阳性细胞为0分，阳性细胞≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分。（2）阳性细胞染色强弱：阴性为无色0分、1分为淡黄色、2分为棕黄色、3分为棕褐色。（1）（2）两项的乘积即为该视野下的免疫组化评分，选取5个视野计算平均分。0～1分为(-);2～4分(+);5～7分(++);≥8分(+++)。
1.3.3统计学方法所有数据均用spss10.0统计程序包进行统计学分析。pten和bcl2在各组之间阳性表达率的差异采用fisher确切概率法检验；两者表达强度之间的相关性用spearman相关分析。p<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1正常鼻咽黏膜和npc组织中pten和bcl2的表达15例正常鼻咽黏膜组织pten蛋白均表达强阳性，而bcl2表达仅局限于基底细胞层，见图1~8。50例低分化npc组织中，pten表达阳性11例，阴性39例(78.0%，χ2=29.250，p=0.000)。bcl2表达阳性41例(82.0%，χ2=23.924，p=0.000)。
2.2pten和 bcl2的表达与临床特征的关系
不同的t分期及有无淋巴结转移之间，pten阳性表达率差异具有统计学意义,其阳性表达为t1 3例，t2 5例，t3 3例，t4 0例,t1与t2 (χ2＝0.026,p＝1.000)、t3与t4(χ2＝1.259,p＝0.545)间阳性表达率差异无统计学意义，t1与t3 (χ2＝6.310,p＝0.038)、t1与t4(χ2＝7.500,p＝0.022) 及t2与t3 (χ2＝7.346,p＝0.015)、t2与t4(χ2＝7.540,p＝0.011)间阳性表达率差异有统计学意义。图1pten在正常鼻咽黏膜中表达强阳性(sp×400)图2pten在鼻咽癌组织中弱阳性表达(sp×400)
2.3npc组织中pten与bcl2的联合表达两者共同表达阳性8例，共同表达阴性6例，pten阳性而bcl2阴性3例，pten阴性而bcl2阳性33例。39例pten ()中，bcl2表达 、+、++、+++者分别为6、7、6、20例；5例pten (+)中，bcl2表达、+++者分别为1、4例；4例pten (++)中，bcl2表达+、++、+++者分别为1、2、1例；2例pten(+++)中，bcl2 ( )2例。作spearman 相关分析，相关系数r=－0.109，p=0.453，表明pten与bcl2在npc中的表达强度无明显相关。
3讨论
抑癌基因pten位于染色体10q23.3，全长200kb，含9个外显子和8个内含子。pten的抑癌作用主要体现在诱导细胞周期停止和程序性细胞死亡，调节细胞的粘连、移动和分化，抑制血管的生成[3]。pten通过pi3k/akt依赖性和非依赖性途径调节细胞生长的整个过程。pten基因调节的pi3k/akt信号途径是一个独立于其他通路的新的生长因子信号传导系统，参与调控细胞的代谢、生长、凋亡、恶变等肿瘤生物学特性[4]。pten基因的突变或缺失导致磷酸酶活性丧失，失去了对细胞增殖的负调控作用，诱导细胞持续增殖，使细胞发生恶性转化，促进了肿瘤的形成。研究发现，pten基因的突变和纯合性丢失见于多种原发性恶性肿瘤，直肠癌中pten蛋白的表达降低或缺失，赋予了癌细胞比较强的侵袭和转移潜能，参与了结直肠癌的侵袭和转移过程[5]。pten在鼻咽癌的发生及发展过程中有表达缺失，且与病理类型、病理分级、临床分期有关[6]。本研究中，正常鼻咽黏膜组pten蛋白表达阳性率明显高于鼻咽癌组，说明pten的低表达与npc的发生相关。同时t1与t2、t3与t4组间阳性表达率差异无统计学意义，t1与t3、t1与t4及t2与t3、t2与t4组间阳性表达率差异有统计学意义，t3～4组pten蛋白表达阳性率明显低于t1～2组，说明了pten的缺失促进了npc细胞的生长。有淋巴结转移组pten蛋白表达阳性率明显低于无淋巴结转移组，表明pten与npc的转移呈负相关。bcl2基因表达的改变不仅影响dna损伤细胞或周期异常细胞的正常凋亡，还影响肿瘤细胞自身的凋亡。尽管bcl2基因家族成员众多，但目前发现与鼻咽癌密切相关的只有四个[7]：bcl2基因、bax基因、bclx基因、eb病毒基因。bcl2基因编码分子量为25～26kd蛋白质，bcl2蛋白位于核膜粗面内质网膜和线粒体膜上，它主要通过稳定线粒体膜电位，阻止细胞色素c和凋亡抑制因子的释放，阻断caspase酶活化的上游信号传递通路等作用，抑制细胞凋亡的发生，最终导致细胞恶变[8]。正常鼻咽黏膜中，bcl2蛋白主要分布在上皮层的基底细胞层。本研究15例正常鼻咽黏膜组织中，均检测到了bcl2的表达，但均局限在上皮层的基底细胞层。这说明bcl2对于维持鼻咽黏膜上皮细胞分化、生长具有重要意义。bcl2在npc组织中呈高表达[9]，本研究npc组织中bcl2蛋白阳性表达率高达82%，且阳性细胞数目多，高者达100%，与正常鼻咽黏膜比较，差异有统计学意义，这说明bcl2蛋白与鼻咽癌的发生相关，可能bcl2基因通过抑制细胞凋亡、延长细胞寿命、增加细胞其他基因突变机会或使已有基因异常改变的细胞逃避凋亡，参与肿瘤的形成[10]。在npc组织中，bcl2的过表达均表现为强阳性，不同的t分期及有无淋巴结转移之间、不同年龄与性别之间bcl2的阳性表达率及表达强度差异均无统计学意义。这说明正常鼻咽黏膜一旦癌变，bcl2的过表达即维持在一个较高的水平。因此可以认为在npc中，bcl2通过抑制已发生转化的细胞凋亡，使其获得进一步积累突变和基因异常的机会，从而在npc发生过程的早期阶段发挥作用，而一旦转化细胞获得恶性表型，bcl2似乎不再起主要作用[11]。本研究的发现与前面提到的两种观点[12]都不尽一致，由于pten的低表达或表达缺失和bcl2强阳性表达在正常黏膜和npc组织中的差异具有统计学意义，因此，我们认为在npc中，pten的低表达与bcl2的高表达在npc的发生中起作用，两者协同参与了npc的发生，这是由于pten基因可明显抑制细胞bcl2蛋白的表达[12]，pten缺失，导致bcl2过表达，共同参与肿瘤的形成。是pten而不是bcl2与npc的t分期及有无淋巴结转移有关，而两者在npc的发展、浸润和转移过程中，未能表现出明显的相关性，其可能机制如下：信号分子3,4,5三磷酸肌醇酯(pip3)是细胞生长主要调节通路的关键因素之一，它同时具有刺激细胞生长和阻止细胞凋亡双重作用。去磷酸化的凋亡前因子bad(也称bclxl/bcl2相关死亡促进子，bclxl/bcl2 associated death promoter)能够与bcl2家族另一成员bclxl形成异源二聚体，从而有利于bax形成同源二聚体，促进细胞凋亡。丝苏氨酸激酶(akt)作为一个已知的原癌蛋白能提高细胞的存活并起到抗凋亡的作用，它通过抑制细胞色素c从线粒体中释放，灭活叉头转录因子fkhr，灭活凋亡前因子bad和caspase9而发挥抗凋亡的活性[13]。pten可以去磷酸化pip3，拮抗pi3k的活性，降低细胞内pip3的浓度，从而抑制akt的激活及其下游激酶的活性，从而导致细胞增殖抑制和细胞凋亡[14]。可见抑癌基因pten缺失后，pip3将刺激细胞生长和阻止细胞凋亡。而bcl2保护发生基因突变的细胞长期生存而不凋亡，但对细胞的增殖无影响[15]。这可能说明为什么pten与npc的t分期及有无淋巴结转移有关，而bcl2却与之无明显相关。
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