【摘要】 目的研究妊娠中期因子（mk）在甲状腺癌中的表达及其临床意义。方法应用rtpcr、原位杂交方法对50例人甲状腺癌组织、30例良性肿瘤组织、30例正常口腔组织进行了mkmrna表达的研究。结果rtpcr分析显示mkmrna在甲状腺癌组织表达量远高于良性肿瘤组织（p<0.01）。本实验中缩短型mk（tmk）仅表达于癌组织。 原位杂交结果显示mk的阳性产物位于癌细胞胞浆中；甲状腺癌组织中mk的表达率明显高于良性肿瘤组织（p<0.01）；转移组mk的表达率明显高于未转移组（p<0.01）。分类及分期观察，mk表达量随着甲状腺癌分期级别的递增呈上升趋势。结论mkmrna在甲状腺癌组织中高表达，并与疾病的恶性度密切相关；tmk可以作为恶性肿瘤标记物；检测mk对临床疾病诊治方案的确定具有参考价值。
【关键词】 妊娠中期因子；甲状腺癌；rtpcr；原位杂交
expression and clinical significance of midkine in thyroid gland carcinoma
wang li1,liang wei2,jiao xiaohui1,lin jiang1
1.college of stomatology，harbin medical university, harbin 150001,china ;2.the second hospital of harbin medical university
corresponding author: jiao xiaohui, email: [email protected]：objective to investigate the expression and clinical significance of midkine mrna in thyroid gland carcinoma.methodsrtpcr and in situ hybridization techniques were employed to detect the expression of mk mrna in 50 cases of thyroid gland carcinoma samples, 30 cases of benign tissue and 30 cases of normal tissue.resultsmkmrna was only detected in thyroid gland carcinoma but normal tissues by rtpcr, it also showed that mk expression were completely different between cancer and benign tissues (p<0.01). in situ hybridization analysis demonstrated that tmk expression was mainly laid in the cytoplasm of cancer cells, which was significantly higher than the control groups (p<0.01). furthermore, we have found that in thyroid gland carcinoma mk expression was coincidently increased with upgrade tumor classification and staging.conclusionmk was highly expressed in thyroid gland carcinoma, and was positively correlated with the progression of malignancy disease. our results showed that examination of mk could be a valuable marker for the clinical diagnostic purpose and treatment of thyroid gland carcinoma disease.
key words：midkine; thyroid gland carcinoma; rtpcr; in situ hybridization
1资料与方法
1.1临床资料与标本80例2002~2004年来自哈尔滨医科大学附属肿瘤医院头颈外科、附属口腔医院颌面外科临床和病理学诊断明确的组织标本，包括50例甲状腺癌（35例发生淋巴结转移，30例正常口腔组织）、30例良性肿瘤组织。Www.11665.coM男48例，女32例，年龄22~75岁，平均年龄55.75岁。所有标本均由临床医师取材保存于液氮中。
1.2主要试剂takara rna pcr kit(amv)ver.3.0、takara taqtm、trizol（大连宝生物工程有限公司），mkmrna原位杂交检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），正义引物：5′atgcagcaccgaggcttcct3′，反义引物： 5′atccaggcttggcgtctagt3′（北京赛百盛公司合成）。
1.3方法
1.3.1rtpcr取组织50mg采用trizol一步抽提法提取总rna，进行反转录，条件：42℃ 45min，99℃ 5min。pcr条件：94℃预变性3min，94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸30sec，共30个循环，72℃延伸10min。pcr产物在含eb的1.5%琼脂糖凝胶上分离、检测。
1.3.2原位杂交3μm厚连续切片分别进行he染色和mk原位杂交。操作步骤按照试剂盒说明书进行。细胞质中出现清晰棕黄色颗粒的细胞为阳性细胞。结果以阳性细胞数所占比例表示，光境（×400）下随机选取10个视野，每个视野计数100个细胞，阳性细胞数≤5%者为阴性（）,6%~15%者为弱阳性（+），16%~50%者为中强阳性（++），>50%者为强阳性（+++）。
1.3.3统计学方法计量资料采用ibas图文处理系统分析处理，采用bandleader分析软件扫描分析电泳各条带的光密度值表示目的基因的表达量，同时采用spss10.0检验进行统计学处理。p<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1rtpcr结果按照设计的引物mk的pcr产物大小不等，有全长型mk（mk）450bp、缩短型mk（tmk）280bp两种，内对照βactin的扩增产物大小为308bp，pcr产物的琼脂糖凝胶电泳结果，见图1、2。
bandleader分析软件扫描分析各条带的光密度值，采用snk方法比较样本均数，见表1。可见甲状腺癌组织与良性肿瘤组织对比，mkmrna表达量差异有统计学意义（p<0.01），癌组织表达多于良性肿瘤组织。甲状腺癌组织与转移淋巴结组织对比，mkmrna的表达量差异无统计学意义（p>0.05）。
全长型mk（mk）和缩短型mk（tmk）在不同组织中的表达情况，见表2。可见50例甲状腺癌组织中有42例表达mk，表达阳性率较高。30例良性肿瘤组织中仅有4例表达，正常组织不表达mk。图1βactin的pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果
2.2原位杂交结果mkmrna的阳性产物位于癌细胞胞浆中，呈棕黄色颗粒，见图3~5，甲状腺癌组织中mkmrna的表达率明显高于良性肿瘤组，见表3（p<0.01），淋巴结转移组mkmrna的表达率明显高于未转移组，见表4（p<0.01）。良性肿瘤组织有4例表达且为弱阳性，正常组织无表达。图3mk在甲状腺癌组织中表达(he染色×10)图4mk在甲状腺癌组织中表达（ish染色×10)图5mk在甲状腺癌组织中表达（ish染色×40)
3讨论
mk是近年来发现的一个新的肝素结合生长因子，其功能首先被定位于神经系统的神经细胞的发育及分化，以后人们发现在消化、循环、呼吸、血液、骨骼、泌尿、生殖等诸多系统中都存在mk，mk不仅与正常的生理功能有关，还与炎症、创伤、修复及肿瘤等病态生理有关，并有着重要的作用，作为一种多功能生长因子已被认同[4]。mk在食管癌、胰腺癌、子宫内膜癌等组织中的表达程度远高于癌旁正常组织[59]。1993年tsutsui等[7]在所观察的wilm’s肿瘤和wilm’s肿瘤抑制基因产物wt1中发现mk高度表达。o’brien等[8]rna酶保护分析法对47例原位膀胱癌和7例正常膀胱组织进行了研究，98%的肿瘤和70%的正常组织中表达了mkmrna，但前者的中值比后者高4倍。kazuhiko等[9]用northern 和western免疫印迹法检测了处于不同阶段的星型细胞瘤标本，mk的表达在高度肿瘤组织（未分化的星型细胞瘤和成胶质细胞瘤）中显著高于低度恶性肿瘤组织。但mk是否在甲状腺癌组织中高表达尚未见报道。本实验结果显示mkmrna的表达率在甲状腺癌组织和良性肿瘤组织中表达差异有统计学意义，癌组织表达多于良性肿瘤组织。bandleader分析软件扫描分析各rtpcr产物的光密度值显示甲状腺癌组织分别与转移淋巴结组织和良性肿瘤组织对比均存在显著差异，这暗示mk的表达与甲状腺肿瘤的恶性程度相关。同时发现9例（18%）甲状腺癌组织表达tmk，6例同时表达mk和tmk，3例仅表达tmk，非癌组织均不表达tmk，提示tmk可作为比mk更有效的肿瘤标记物用于临床诊断。我们运用原位杂交检测mk表达时发现甲状腺癌组织中42例（84%）表达mk，良性肿瘤组织中仅有4例（13.33%）表达，正常组织无表达，可见mk在癌组织呈现高表达。将癌组织分为有、无淋巴结转移进行分析：转移组35例中有34例（97.14%）表达，未转移组15例中有8例（53.33%）表达。进行分期研究发现：mk表达量随着甲状腺癌分期级别的递增呈上升趋势，尤其是ⅲ期和ⅳ期有淋巴结转移的病例中mk表达量多呈中强或强阳性。这进一步证实mk在甲状腺肿瘤中表达程度与肿瘤的恶性程度和转移有较强的关系，可作为甲状腺肿瘤的早期诊断的一项指标，有利于我们进一步了解甲状腺肿瘤的生物学行为。我们研究中采用的两种方法检测结果是一致的，与mk在其他癌组织的研究结果具有一致性。rtpcr更具直观性，原位杂交检验更为微观的表达，而且将其表达准确定位[10]。本研究将为甲状腺肿瘤临床和基础工作提供了具有参考价值的信息。
【参考文献】
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