【摘要】 目的 检测survivin在人宫颈癌前病变和宫颈浸润癌组织中的表达，探讨其与宫颈癌发生发展的关系，评估其临床应用价值。方法 采用免疫组化技术和实时荧光定量pcr技术检测30例宫颈浸润癌、15例癌前病变和10例宫颈炎组织中survivin的表达。结果 （1）survivin蛋白和survivin mrna在宫颈炎组织中仅微量表达，在宫颈癌前病变和宫颈癌组织的表达依次显著增强（p＜0.05和p＜0.01）, survivin mrna在宫颈癌前病变和浸润癌组织中的表达量分别是宫颈炎组的11.0倍和22.6倍。（2）在宫颈癌前病变、宫颈浸润癌组织中survivin mrna和蛋白两者的表达量均呈正相关（p=0.02和p=0.01），而在宫颈炎组织中两者无明显相关性。结论 survivin与宫颈癌的发生发展密切相关，是一个具有重要临床意义的特异性肿瘤标记物，应用实时荧光定量pcr技术检测survivin可做为宫颈癌早期诊断的可靠方法。
【关键词】 survivin 宫颈癌 癌前病变 实时荧光定量pcr 疫组化
survivin蛋白是目前发现的作用显著的凋亡抑制因子，以杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列（baculoviral iap reapeat, bir）与caspase3、7、9结合抑制细胞凋亡，并定位于着丝点和中心纺锤体上而发挥调控细胞周期的作用[1，2]。WWW.11665.Comsurvivin蛋白在多种恶性肿瘤中过量表达，与肿瘤的发病、侵润及预后密切相关，survivin蛋白在宫颈癌中过量表达已经免疫组化法证实，但其复杂的功能与亚细胞定位的关系仍未阐明，另外， survivin mrna在宫颈癌及其癌前病变组织中的定量检测，及其能否在转录水平上调控survivin蛋白的表达仍待研究。本研究采用免疫组化法和实时荧光定量pcr技术检测宫颈癌和宫颈癌前病变中survivin mrna和survivin蛋白的表达，以期评估survivin作为一个肿瘤特异性因子在宫颈癌早期诊断及预测患病危险度中的价值。
1 资料和方法
1.1 资料
1.1.1 标本来源和处理 所有标本均取自三峡大学第一附属医院妇科住院部手术病例和门诊阴道镜室病理活组织检查病例，包括10例宫颈炎组织、15例癌前病变组织和30例宫颈浸润癌组织。患者之前均未做过放化疗。所有标本均由病理科确诊，按组织学分级：高分化5例， 中分化15例， 低分化10例。临床分级按figo1995年标准：30例宫颈癌病例均为磷癌，其中ⅰ期 14例，ⅱ期16例。三组的平均年龄为47岁。标本离体后立即分为两份，一份放入液氮中速冻，然后移至-80℃冰箱保存待用；另一部分置于10%福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋，4μm连续切片。
1.1.2 主要试剂 即用型survivin多克隆抗体和sabc免疫组化试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司,实时荧光定量pcr相关试剂均购自宝生物工程（大连）有限公司。
1.1.3 引物和探针 survivin(nm_001012271)探针和引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。survivinf:5′aacactgctgtggaccctact3′, survivinr：5′gacaactgcgtctctg cca g3′, survivinp：5′(fam)catcctcactgcggctgtctgggc (eclipse)3′, 扩增片段长度为129bp。gapdhf:5′ccaggtggtctcctctgactt3′,gapdhr：5′gttg ctgtagccaaat tcgttgt3′，gapdhp：5′（fam）aacagcgacacccac tcctccacc（eclipse）3′, 扩增片段长度为130bp。
1.2 方法
1.2.1 免疫组化
1.2.1.1 免疫组化sabc法检测survivin蛋白的表达 切片常规脱蜡水化,微波修复10min,严格按照试剂盒说明书进行操作,用已知阳性片作为阳性对照，将磷酸盐缓冲液代替一抗做为阴性对照。
1.2.1.2 免疫组化染色特征和图像分析 survivin阳性染色判断：以出现淡黄色至深棕黄色为阳性，见图1、2。运用leica q500iw(德国)自动图像分析系统,在×400镜下随机选取5个视野,提取阳性区域测定总光密度值（sum iod）。
1.2.2 实时荧光定量pcr法检测survivin mrna表达
1.2.2.1 总rna提取和cdna合成 严格按trizol说明书提取组织总rna，所提取的总rna通过a280/a260比率检测其纯度；经1.5% 琼脂糖凝胶电泳鉴定,可见明显的28s、18s两条带,证明其完整性。之后立即进行反转录，反应体系为25μl，取11μl总rna中与1μl oligo(dt)15primer混匀，70℃水浴5min后冰上骤冷，再分别加入：mmlv 5×reaction buffer 5μl, 10mmdntps 5μl, rna酶抑制剂 25u，200u/μl mmlv 反转录酶1μl，加depc水至25μl；37℃水浴60min，反应后产物于-20℃冰箱中保存待用。
1.2.2.2 实时荧光定量pcr （1）dna标准品的制备 dna标准品为构建的线性化质粒，是将519bp目的基因片段克隆到pmd 18t vector上，然后将纯化后的质粒用hindⅲ限制酶进行线性化处理，经pci抽提、乙醇精制后得到标准品。在分光光度仪上测的od260和od320的值，依据公式：（od260od320）×稀释倍数×50计算出标准品的浓度。依据公式：标准品浓度×6.02×1023×109/(目的片段长度+质粒dna长度)×660计算出survivin的纯化质粒的拷贝数为6.0×1010,用easy dilution按10倍梯度进行稀释 (107、106、105、104、103、102 、101copies/μl)作为制作survivin基因的标准曲线的模板。
（2）标准品和样本模板的扩增 将标准品和样本模板同时进行扩增，反应总体积为25μl，反应体系包括cdna反转录液2μl，5μmol/l正、反向引物各0.5μl，6μmol/l探针0.6μl, takara ex taq hs 0.25μl, 5×real time pcr buffer(mg2+ free) 5μl, dntps mixture(10mmol/l)0.75μl, mg2+ solution (250mmol/l)0.5μl，加水至25μl。扩增条件为：95℃ 5min灭活反转录酶；随后进入扩增循环95℃ 5s、60℃ 20s，45个循环后反应结束后，根据pcr扩增曲线得出各测量标本的ct（threshold cycle）值，见图3。每批标本均以标准质粒作为阳性对照以水作为阴性对照，所有实验标本均重复扩增3次。以（1×107～1×101 ）copy/μl 7个浓度的标准品ct值绘制标准曲线图，见图4。根据gapdh的ct值校正survivin的ct值，依据校正后的ct值根据计算出每个模板的起始拷贝数。
1.3 统计学处理
采用spss11.0统计软件进行t检验、单因素方差分析和直线回归分析，p＜0.05为差异有统计学意义。表1 survivin蛋白和survivin mrna在宫颈炎、宫颈癌前病变及浸润癌组织中的表达及相关性表2 宫颈浸润癌中survivn蛋白和survivin mrna的表达量与各临床病理参数的关系
2 结果
2.1 survivin蛋白在宫颈炎、宫颈癌前病变及宫颈浸润癌组织中的表达
镜下示survivin蛋白主要定位于细胞浆内，见图1、2。在宫颈炎、宫颈癌前病变和宫颈浸润癌组织中均表达，但三者间均存在显著的统计学差异（p＜0.05），宫颈浸润癌中表达量最高，而宫颈炎组织中仅微量表达，见表1。
2.2 survivin mrna在宫颈炎、癌前病变及宫颈浸润癌组织中的表达特点
10例宫颈炎组织、15例宫颈癌前病变组织、30例宫颈浸润癌组织中均检测到survivin mrna，结果提示gapdh在所有检测标本中亦均表达。survivin mrna在宫颈炎组织中仅微量表达，在癌前病变和浸润癌中表达逐步明显增高，见表1，具有显著统计学意义（p＜0.05）。
2.3 survivin蛋白和survivin mrna的表达量与宫颈癌临床病理特征的相关性
宫颈浸润癌中survivin蛋白和survivin mrna的表达量在临床分期组间差异均有统计学意义（p＜0.05），而在年龄、组织学分级分组间的表达量无统计学差异，见表2。
2.4 宫颈炎、宫颈癌前病变及浸润癌组织中survivin蛋白和survivin mrna表达量的关系
癌前病变和宫颈浸润癌组织中survivin蛋白和survivin mrna的表达量均显著相关（p=0.03和p=0.01）,而在宫颈炎组织中两者无相关性，见表1。
3 讨论
抗凋亡分子表达上调是恶性转化细胞和肿瘤细胞逃避凋亡机制的主要途径之一，survivin是目前发现的抗凋亡作用最强的肿瘤特异性因子之一，其组织分布具有明显的肿瘤特异性，在胚胎组织中表达丰富，在除胎盘、胸腺和生殖腺外的正常分化组织和癌旁组织均无表达，而在细胞发生转化和恶变时又重新表达，在大多数肿瘤组织中如：肺癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌等过量表达。目前研究者们利用反义寡核苷酸、rna构成酶、survivin反义表达载体、基因沉默技术和疫苗等方法靶向作用于survivin用于肿瘤的诊断和治疗[3]。
survivin做为一个具有潜在临床价值的肿瘤标记物，在宫颈癌中的相关研究还甚少。本实验免疫组化实验数据表明survivin蛋白随着宫颈病变的进展表达量逐步明显增高，而在宫颈炎组织中仅微量表达，与以往报道一致[4，5]，此外，vischioni b等[6]指出survivin蛋白复杂的功能依赖其亚细胞定位，本实验结果表明survivin蛋白在宫颈浸润癌中主要定位于细胞浆，提示其复杂的功能在胞质中被实现，与li f等[7]结果一致。survivin mrna过量表达已在多种肿瘤中得到证实[8，9]，我们的实验数据提示其在宫颈炎组织、宫颈癌前病变和宫颈浸润癌组织中的表达量分别为：0.9×105,10.3×105 ,20.3×105，在宫颈癌前病变组织中的表达量比宫颈炎组织高11倍，浸润癌组织中表达量比癌前病变高22.6倍，三者间比较差异有显著的统计学意义，提示survivin mrna可作为宫颈癌早期诊断和预测患病危险度的一个可靠指标。此外survivin mrna与患者年龄、组织学分级无关，仅与临床分期相关，但magali e等[10]采用半定量技术检测指出survivin mrna 在宫颈癌的高表达与年龄、临床分期、 组织学分级、绝经状态均无关，其与临床的相关性尚需进一步研究。
我们分析survivin mrna和survivin蛋白在宫颈炎、宫颈癌前病变和宫颈浸润癌中的表达量，结果发现在宫颈癌前病变和宫颈浸润癌两组中蛋白和基因的表达量均显著相关，而在宫颈炎组两者无相关性，提示survivin mrna表达量的不同可能反应到蛋白水平，survivin蛋白的表达在转录水平上受到调控。本实验所采用的实时荧光定量pcr技术快速、灵敏度高、特异性强，如果我们的结果在大量研究中得以证实，将为survivin作为宫颈癌早期诊断、预测患病危险度的一个可靠肿瘤标记物提供理论依据。
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