【摘要】 目的 人精子蛋白17（sperm protein 17，sp17）正常情况下局限表达于睾丸，近年发现在上皮性卵巢癌等恶性肿瘤中异常表达，已被列入ct（cancer/testis）抗原家族。我们研究该蛋白在不同病理类型的子宫内膜癌和宫颈癌中的表达频度、分布类型以及与肿瘤临床分期分级的关系，旨在探讨sp17是否可能成为相关妇科肿瘤诊断标志和治疗靶标。方法 用免疫组化技术检测81例石蜡包埋的妇科恶性肿瘤组织标本中sp17的表达，其中包括50例子宫内膜癌（腺癌44例、腺鳞癌6例）和31例宫颈癌（鳞癌17例、腺癌14例）。结果 子宫内膜癌组织sp17的阳性率为66%（33/50），其中腺癌29例阳性，腺鳞癌4例阳性，表达模式呈异质性，sp17表达与肿瘤分化程度和临床分期均无相关性。宫颈癌组织sp17总阳性率32.2%（10/31），鳞癌23.5%(4/17)，腺癌42.8%(6/14)。结论 sp17在子宫内膜癌和宫颈腺癌中呈高水平异常表达，尽管其表达与肿瘤分化程度和临床分期无明显相关，仍有可能作为肿瘤体内显像诊断和免疫治疗的分子靶标。
【关键词】 精子蛋白17 子宫内膜癌
癌瘤睾丸抗原（cancertestis antigen, ct抗原）是近来倍受重视的一类肿瘤相关抗原，由于这类抗原的独特组织特异性，使它们成为肿瘤生物治疗和诊断的侯选分子[1]。www.11665.coMct抗原具有如下特征：在男性生殖细胞中高水平表达，在正常体细胞中很少表达，在多种类型的肿瘤中异常表达。目前为人熟知的ct抗原家族包括黑色素瘤抗原（mage、bage、gage），食管癌抗原（nyeso1）和肾癌抗原（scp1）等。
精子蛋白17（sperm protein 17, sp17）是新发现的一种ct抗原。sp17最初在兔附睾的精子膜和睾丸膜沉淀物中分离出来，继而从人睾丸cdna文库中克隆该蛋白基因并测序[2]，人和其他哺乳动物sp17有很高的同源性。人sp17分子由151个氨基酸组成，其表观分子质量为24.5×103，主要生物学功能是参与受精过程中精子顶体与卵子透明带反应。
曾用rtpcr技术和免疫组化技术对病理诊断明确的卵巢恶性肿瘤表达sp17的情况进行研究。结果表明，新鲜原发性卵巢癌组织标本sp17 mrna阳性率达到84.5%[3]，44%的上皮性卵巢癌中不同程度地出现sp17蛋白的异常表达，而且发现腹水中的转移卵巢癌细胞依然表达sp17[4, 5]。由于sp17的生物学功能是促进受精，在女性体内很少表达且尚未发现生理作用，因此，sp17可能是妇科恶性肿瘤体内分子显像诊断和肿瘤生物治疗的理想靶标。为了查明sp17在另外两种妇科常见恶性肿瘤中的表达情况，我们用免疫组化法对50例子宫内膜癌和31例宫颈癌标本进行了研究。
1 资料与方法
1.1 组织标本
选取1995年3月～2005年12月间南京军区南京总医院病理科的妇科肿瘤标本存档蜡块，所有病例均经病理学确诊。子宫内膜癌50例（腺癌44例、腺鳞癌6例），年龄34～71岁，中位年龄54岁；宫颈癌31例（鳞癌17例、腺癌14例），年龄17～72岁，中位年龄46岁。另取10例临床诊断为功能性子宫出血患者诊断性刮宫的子宫内膜组织作为阴性对照。
1.2 主要试剂
抗sp17单克隆抗体由本实验室制备[6]，免疫组化试剂盒和dab显色液为福州迈新公司产品。
1.3 免疫组化染色
手术标本均经10%甲醛固定，常规石蜡包埋，3μm连续切片，贴附于涂有100g/l多聚赖氨酸的载玻片上。脱蜡后，滴加0.03ml/l甲醇h2o2孵育30min，再于微波炉中煮沸1min。加100ml/l羊血清pbs封闭30min，用pbst洗3次，滴加1∶300的sp17mab，4℃孵育过夜，漂洗3次，再按sp法常规操作。滴加dab底物溶液显色10min后，再以苏木素复染1min，脱水，透明及封片，在光学显微镜下观察结果并照像。根据染色强度与范围作出每张切片分级。以着色程度及计数100个细胞中的阳性细胞数来判定。阴性（-）：细胞无着色或阳性细胞数＜5%；（+）：阳性细胞数≤25%；（++）：细胞着色染成黄色，阳性细胞数26%～50%；（+++）：阳性细胞数51%～75%；（++++）：阳性细胞数＞75%。
1.4 统计学处理
用 spss12.0软件完成。两组阳性率的比较采用fisher精确概率法。用秩和检验（wilcoxon）进行两等级指标的相关性分析。p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 免疫组化
sp17在不同组织类型子宫内膜癌和宫颈癌中的表达频度，见表1。sp17在子宫内膜癌和宫颈癌组织标本均有异常表达，特别是子宫内膜癌，其阳性率和染色强度均显著高于宫颈癌。50例子宫内膜癌标本，33例有sp17表达，阳性率达66%，其中腺癌和腺鳞癌阳性率相同。所有阳性细胞的sp17蛋白主要表达在细胞浆，被染成黄褐色。sp17表达模式呈异质性，相同病理类型的肿瘤组织中有弥漫性、分散性和局灶性表达，见图1。31例宫颈癌，10例不同程度表达sp17（32%），阳性细胞均呈灶性分布，见图2a、b。腺癌阳性率高于鳞癌，但由于病例数太少，差异无统计学意义（χ2＝1.312，p＝0.252）。10例阴性对照标本，2例出现sp17局灶表达，阳性率20%，表达强度为+，病理诊断为简单型子宫内膜增殖症。
2.2 子宫内膜癌中sp17表达与临床病理特征的关系
sp17表达与肿瘤病理及临床特征的关系，见表2。经过统计分析，sp17表达与肿瘤分化程度和临床分期均无相关性。表1 sp17在不同组织类型子宫内膜癌和宫颈癌中的表达频度 表2 子宫内膜癌sp17表达与临床病理特征的关系
3 讨论
卵巢癌、子宫内膜癌和宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤，早期诊断预后较好，晚期患者的治疗只能采取化疗和放疗，疗效有限。迫切需要寻找有用的肿瘤相关抗原，发展更敏感的分子影像诊断技术，以提高肿瘤的早期诊断率，同时发展针对肿瘤抗原的免疫治疗方法，延长晚期患者的生存时间。
ct抗原是近年来陆续鉴定的一组肿瘤相关抗原，目前报道的有44种[1]，其主要特点是在睾丸生殖细胞中丰富表达，在其他体细胞中限制表达，在多种恶性肿瘤中异常表达。ct抗原的限制表达特性及高免疫原性，使其成为肿瘤免疫治疗的理想靶点。sp17是ct抗原一个新成员，已经发现在多种恶性肿瘤细胞系和多发性骨髓瘤（mm）、卵巢癌、食管癌的临床肿瘤标本中异常表达[79]。sp17既有b细胞表位又有细胞毒t淋巴细胞（ctl）表位，已经从正常供体、mm患者和卵巢癌患者制备出能杀伤hla相配的sp17+的肿瘤细胞的ctl，提示sp17是免疫治疗的理想疫苗[10, 11]。但是，目前对sp17在各种临床肿瘤标本中的表达研究得尚不充分。我们拟将sp17作为妇科肿瘤诊治靶标，曾对卵巢癌组织标本中sp17表达作过调查[3, 4]，现又将研究范围扩展到子宫内膜癌和宫颈癌。结果发现，子宫内膜癌组织sp17的阳性率为66%（33/50），在上述3种妇科恶性肿瘤中阳性率最高，而且sp17在癌组织中的表达量也最大，其中腺癌29例阳性，腺鳞癌4例阳性，表达模式与卵巢癌中一样，呈异质性，sp17表达与肿瘤分化程度和临床分期均无相关性。宫颈癌组织sp17总阳性率32.2%（10/31），鳞癌23.5%(4/17)，腺癌42.8%(6/14)，sp17阳性细胞在肿瘤组织中呈局灶性分布。
本研究在部分简单型子宫内膜增殖症的子宫内膜组织中也检测到sp17的表达，但表达水平很低。2003年，chirivainternati在正常输精管、女性生殖道、气管、肺和咽喉的上皮细胞中发现sp17表达，对sp17作为肿瘤疫苗的安全性产生了质疑[12]，后来zhang等[13]分别应用实时定量 rtpcr和免疫组化技术检测正常组织中sp17表达情况，结果表明，20种正常组织sp17 mrna的表达水平仅为睾丸的0～2%，用组织微阵列作免疫组化，在30种正常组织中未检出sp17蛋白的表达。因此，他们认为sp17是一个ct抗原，适合作为免疫治疗的靶点。
总之，ct抗原sp17在妇科常见的3种恶性肿瘤组织中都有大量异常表达，尤其以子宫内膜癌表达水平最高。虽然sp17表达与肿瘤的恶性程度和临床分期无相关性，而且在部分非恶性增生的组织中亦有少量表达，该抗原仍然可望作为妇科肿瘤体内分子显像诊断和免疫治疗的靶标。
【参考文献】
［1］ simpson ajg, caballero ol, jungbluth a, et al. cancer/testis antigens: gametogenesis and cancer[j]. nat rev cancer，2005, 5:615625.
[2] lea ia, richardson rt, widgren ee, et al. cloning and sequencing of cdnas encoding the human sperm protein, sp17[j]. biochim biophys acta，1996, 1307 (3): 263266.
[3] 李芳秋，杨爱龙，刘群，等. 精子蛋白17 mrna在卵巢癌中的表达及临床意义[j]. 医学研究生学报，2005, 18(6): 493495.
[4] 李芳秋，杨爱龙，黄文斌，等. 精子蛋白17在上皮性卵巢癌中的异常表达[j]. 中华肿瘤防治杂志，2006, 13(15): 4750.
[5] straughn j m, jr shaw dr, guerrero a, et al. expression of sperm protein 17 (sp17) in ovarian cancer[j]. int j cancer，2004, 108 (6):805811.
[6] 李芳秋，杨爱龙，缪家文，等. 人精子蛋白17单克隆抗体的制备及特性鉴定[j].细胞与分子免疫学杂志，2006, 22(5): 638640.
[7] lim sh, wang zq, chirivainternati m, et al. sperm protein 17 is a novel cancertestis antigen in multiple myeloma[j]. blood， 2001, 97(5):15081510.
[8] grizzi f, gaetani p, franceschini b, et al. sperm protein 17 is expressed in human nervous system tumours[j]. bmc cancer， 2006, 6:23.
[9] gupta g, sharma r, chattopadhyay tk, et al. clinical significance of sperm protein 17 expression and immunogenicity in esophageal cancer[j]. int j cancer， 2007, 120(8): 17391748.
[10]chirivainternati m, wang z, salati e, et al. tumor vaccine for ovarian carcinoma targeting sperm protein 17[j]. cancer， 2002, 94 (9):24472453.
[11]chirivainternati m, wang z, salati e, et al. successful generation of sperm protein (sp17)specific cytotoxic t lymphocytes from normal donors: implication for tumorspecific adoptive immunotherapy following allogeneic stem cell transplantation for sp17positive multiple myeloma[j]. scand j immunol， 2002, 56(4):429433.
[12]chirivainternati m, grizzi f, franceschini b, et al. is sperm protein 17 a useful target for tumor immunotherapy[j]? blood， 2003, 102(6):23082309.
[13]zhang y, wang z, robinson wr, et al. combined real time pcr and immunohistochemical evaluation of sperm protein 17 as a cancertestis antigen[j]. eur j haematol， 2004， 73(4): 280284.
［编辑：安 凤；校对：杨 卉］
