【摘要】 ［目的］ 利用乏氧显像监测紫杉醇脂质体节奏性化疗过程中胃癌的乏氧变化。［方法］36只荷人胃癌hs-746t细胞的雄性裸鼠（4~6周）随机分成两组，治疗组按5mg/kg的剂量每3天一次行腹腔内注射紫杉醇脂质体，对照组注射同体积的生理盐水。治疗后第2d和14d利用spect全身静态扫描显示注射99mtc-hl91后5，10，15，30，60，120和180min的显像。在显像上标记感兴趣区为靶点，计算各组靶/非靶比值。然后处死裸鼠、切下肿瘤行称重和放射性计数。通过免疫组织化学染色检测cd34表达，计算肿瘤微血管密度（mvd）。 ［结果］ 治疗后第2d，紫杉醇脂质体治疗组t/nt低于对照组（7.82±0.28 vs. 9.56±0.31，p<0.05），离体肿瘤放射性滞留降低（0.71±0.03 vs. 0.97±0.03，p<0.05），mvd降低（42.89±2.63 vs. 52.78±3.09，p<0.05）；治疗后第14d，治疗组t/nt高于对照组（11.54±0.42 vs. 9.96±0.28，p<0.05），离体肿瘤放射性滞留升高（1.42±0.05 vs. 11.54±0.42，p<0.05），mvd明显降低（27.89±2.51 vs. 66.11±2.83，p<0.001）。 ［结论］ 治疗初期紫杉醇脂质体降低胃癌乏氧，后期乏氧增加，乏氧监测对胃癌的治疗有一定的指导意义。
【关键词】 胃癌细胞
experimental study of effects of metronomic chemotherapy with paclitaxel-liposomes on gastric cancer hypoxia
zheng yong-bin, tong shi-lun, he jie, et al.
(renmin hospital of wuhan university, wuhan 430060, china)
abstract: ［purpose］ to monitor the hypoxic change of gastric cancer during metronomic chemotherapy with paclitaxel-liposomes by the hypoxia imaging. ［methods］ thirty-six male nude mice bearing human gastric cancer hs-746t cells were randomly divided into two groups: the treatment group received paclitaxel-liposomes at a dose of 5mg/kg intraperitoneally and control group received the same volume of saline in every three days. on 2 and 14 days, all the mice underwent static whole body planar imaging with spect at 5, 10, 15, 30, 60, 120 and 180 minutes after injection of 99mtc-hl91. region of interest, roi were drawn as the target in planar imagines and target-to-non targeted (t/nt) were calculated. then the mice were sacrificed and the tumors were removed, weighted and the radioactivities were measured. cd34 expressions were detected by immunohistochemical staining and microvascular densities (mvd) of the tumors were calculated. ［results］ on the second days after paclitaxel-liposomes treatment, t/nt ratio of treatment group was significantly lesser than that of control group（7.82±0.28 vs. 9.56±0.31, p<0.05）, the radioactive retention and the mvds of isolated tumor tissues in the treatment group were lesser than those of control （0.71±0.03 vs. 0.97±0.03,p<0.05） （42.89±2.63 vs. 52.78±3.09,p<0.05）. on 14 days after treatment, t/nt ratio and the radioactive retention of treatment group were significantly higher than those of control group （11.54±0.42 vs. 9.96±0.28,p<0.05） （1.42±0.05 vs. 11.54±0.42,p<0.05）. the mvd of isolated tumor tissues in the treatment group was significantly lesser than that in control（27.89±2.51 vs. 66.11±2.83,p<0.001）. ［conclusion］ in the early stage of the treatment, paclitaxel-liposomes decrease the hypoxia of gastric cancer and in the late stage of treatment which increases the tumor hypoxia. therefore, detection tumor hypoxia may be important in guiding the treatment for gastric cancer.
key words: 99mtc-hl91; paclitaxel-liposomes; tumor hypoxia; nude mice
多数实体瘤中存在不同程度的乏氧细胞，乏氧是肿瘤异质性的重要特征。wWW.11665.CoM实验及临床数据显示乏氧不仅是导致放疗失败和化疗耐受的重要原因，而且使肿瘤具有侵袭性，易发生治疗后复发和远处转移，为肿瘤治疗带来很大困难。我们在荷人胃癌细胞(hs-746t)的裸鼠异种移植模型上，研究了紫杉醇脂质体治疗后胃癌的乏氧变化。
1 材料与方法
1.1 试 剂
rpmi-1640培养液和胰酶购于gibco公司， hs-746t细胞系来自中国典型培养物保存中心，紫杉醇脂质体（力扑素）由南京思科药业有限公司惠赠。
1.2 显像剂制备
hl91药盒由北京欣科思达医药科技有限公司提供。99mtc-hl91标记方法：取hl91冻干品1支，加入约925mbq（2ml）新鲜99mtc淋洗液，使其全部溶解，室温放置10min即可。采用双体系展开测定放化纯度：①新华一号滤纸，甲醇为展开剂。②硅胶g层析板：生理盐水为展开剂，标记率>90%。
1.3 主要仪器
美国ge公司的 discovery vh型符合线路spect，配置针孔准直器。科大创新股份有限公司的gc-1200γ放射免疫计数器。
1.4 实验动物
4～6周龄雄性裸鼠balb/c 36只，体重18g～20g，由武汉大学人民医院实验动物中心提供，并在该中心spf（specific pathogen free）条件下饲养。
1.5 实验方法
1.5.1 人hs-746t细胞培养与单细胞悬液的制备
含10%小牛血清的rpmi-1640，37℃，5%co2孵箱培养，每1～2d换液1次，3～4d后可长成单层细胞，每3d传代1次。取对数生长期细胞，生理盐水配制成单细胞悬液，台盼蓝（trypan blue）染色，活细胞＞95%，生理盐水将细胞浓度调整到1×108/ml。
1.5.2 荷人hs-746t细胞的裸鼠异种移植模型的建立及治疗方法
裸鼠双前肢皮下分别用1ml的微量注射器，注射hs-746t单细胞悬液200μl，2周后，肿瘤长径至2mm～5mm时，随机将裸鼠分成4组（每组n=9）：1、3为治疗组，按5mg/kg腹腔注射紫杉醇脂质体，2、4为对照组，腹腔注射同体积的生理盐水；两组均为每3天注射1次，连续使用2周。1、2组于初次治疗后第2d，3、4组于治疗后第14d测量肿瘤乏氧和微血管密度（mvd）。
1.5.3 99mtc-hl91荷瘤裸鼠全身显像
裸鼠腹腔注射20%乌拉坦(800mg/kg～1 000mg/kg)麻醉，仰卧固定，经尾静脉注射99mtc-hl91 37mbq(1mci)，以spect ge millenium vg仪采集注射后5min、10min、15min、30min、1h、2h、3h荷瘤裸鼠全身静态后位平面图像。采集条件：针孔准直器，256×256 矩阵，放大倍数4.0，采集时间10min。在荷瘤裸鼠99mtc-hl91显像图像上勾画肿瘤和下肢的感兴趣区（roi），测量各roi内平均放射性计数，计算出靶和非靶组织放射性比值(t/nt)。取3h的显影的t/nt比值代表组织乏氧状态，测定各组肿瘤的乏氧情况。离体肿瘤组织放射性分析：裸鼠全身乏氧显像3h后处死裸鼠，剥离肿瘤组织，称重，测量放射性计数[1]。
1.5.4 免疫组织化学染色及结果判断
肿瘤组织于10%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，连续切片（4μm），cd34免疫组织化学染色。采用s-p法，按试剂盒说明逐步操作。各组标本同一批染色，以pbs代替一抗作阴性对照。按照weidner[2]标准计算mvd。
1.6 统计学处理
统计学软件为spss10.0，所有数据以x±s表示，组间比较采用方差分析。
2 结 果
2.1 乏氧测定
荷瘤裸鼠注射99mtc-hl91后自5min起肿瘤部位放射性增高，显影开始清晰，对照组肿瘤于3h显影更为明显,与周围组织有较高的对比度（图1）；治疗后第2d，3h显影治疗组t/nt比值和肿瘤的放射性滞留时间低于对照组；而治疗后在第14d治疗组t/nt比值和肿瘤的放射性滞留时间高于对照组（p<0.05）（表1）。
2.2 瘤重和mvd
治疗后第2d治疗组和对照组的瘤重无明显区别，第14d治疗组肿瘤的生长受到抑制，瘤重明显低于对照组。cd34标记血管内皮细胞，所有肿瘤组织均有阳性表达（图2），内皮细胞被染成棕黄色，微血管有的形成管腔，有的仅为单个内皮细胞或内皮细胞簇，肿瘤边缘组织的mvd高于中央。治疗后第2d治疗组瘤组织中mvd少于对照组（42.89±2.63 vs. 52.78±3.09，p<0.05)。治疗后第14d治疗组瘤组织中mvd明显少于对照组（27.89±2.51 vs. 66.11±2.83，p<0.01）和第2d治疗组（27.89±2.51 vs. 42.89±2.63，p<0.01）。
3 讨 论
紫杉醇是一种细胞生长抑制剂，其药用溶媒聚氧乙基代蓖麻油进入体内后有可能引起危及生命的超敏反应，为减少该反应的发生，我们应用紫杉醇脂质体进行实验，脂质体作为载体具有降低毒性，减轻变态反应和免疫反应等特点[3]。本实验结果显示裸鼠对紫杉醇脂质体耐受良好，无过敏反应出现。
紫杉醇除了对多种肿瘤细胞具有细胞毒作用外，同时也是一种特异性内皮细胞迁移抑制剂，能抑制肿瘤的血管生成，特别是通过节奏性给药的方式能显著导致肿瘤局部缺血、缺氧，引起肿瘤组织坏死[4]，但其是否将进一步促进肿瘤乏氧尚不得而知。本实验结果提示，紫杉醇治疗后第2d肿瘤乏氧降低，第14d乏氧明显增高，提示紫杉醇治疗后肿瘤的乏氧变化并不固定。该观察结果与先前国内外的相关研究结论相符合。如webb等[5]观察了在dc101治疗后肿瘤乏氧的变化情况，发现第2d乏氧减少，在第5d几乎完全消失，在第8d再次增加； ansiaux等[6]监测了抗血管生成治疗后1～5d内的肿瘤组织氧合的动态变化曲线，同样发现其为先降低后增加。jain[7]为解释该现象提出了“肿瘤血管正常化窗口”的假设，某些抗肿瘤血管生成剂能暂时“正常化”结构和功能异常的肿瘤血管，使之更有效地传递氧和释放化疗药物。我们的实验也证实了部分化疗药物通过节奏性给药的方式也能诱导“肿瘤血管正常化窗口”。在我们的实验中紫杉醇治疗后第2d mvd减少，第14d减少更为明显，故我们推测紫杉醇脂质体给药后能部分删减异常的肿瘤血管，改善肿瘤组织血供，导致局部乏氧减少，最后由于血管的广泛损伤，肿瘤组织血流减少，从而增加肿瘤组织乏氧。
紫杉醇能直接杀死癌细胞，又能影响肿瘤局部的乏氧，因此可以设想在紫杉醇治疗初期，肿瘤乏氧降低，放化疗更容易到达肿瘤局部进而增加其疗效，此期宜联合放化疗措施；在紫杉醇治疗后期，肿瘤乏氧增加，此期联合应用紫杉醇和乏氧特异性细胞毒物质的治疗方案，也许是控制肿瘤的较佳选择[1]。
【参考文献】
[1] 郑勇斌, 陈道达, 许天文, 等. 泰素帝影响肿瘤乏氧的实验研究[j]. 亚洲核医学杂志, 2005, 5(1):38-41.
[2] weidner n. current pathologic methods for measuring intratumoral microvessel density within breast carcinoma and other solid tumors[j]. breast cancer res treat, 1995, 36(2):169-180.
[3] holvoet c, vander heyden y, lories g, et al. preparation and evaluation of paclitaxel-containing liposomes[j]. pharmazie, 2007, 62(2):126-132.
[4] ng ss,sparreboom a, shaked y, et al. influence of formulation vehicle on metronomic taxane chemotherapy: albumin-bound versus cremophor el-based paclitaxel[j]. clin cancer res, 2006, 12(14 pt 1):4331-4338.
[5] webb t. vascular normalization: study examines how antiangiogenesis therapies work[j]. j natl cancer inst, 2005, 97(5):336-337.
[6] ansiaux r, baudelet c, jordan bf, et al. thalidomide radiosensitizes tumors through early changes in the tumor microenvironment[j]. clin cancer res, 2005, 11(2 pt 1):743-750.
[7] jain rk. normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy[j]. science, 2005,307(5706):58-62.
