紫杉醇与顺铂联合应用对人胃癌sgc7901细胞的作用
【关键词】 pa;cddp;体外研究;胃癌
【摘要】 目的 研究紫杉醇 (pa) 联合顺铂 (cddp) 对人胃癌sgc7901细胞株的影响。方法 采用mtt法检测两种药物单用和联合应用对细胞的作用，光镜和电镜观察细胞结构的变化,流式细胞仪检测sgc7901细胞周期分布及端粒酶的活性。结果 pa可抑制sgc7901细胞的生长，且呈剂量及时间依赖性(p<0.05);光学显微镜下可见经 pa和cddp培养的胃癌细胞核周存在异常物质，电镜下在细胞内可见异常致密物;pa对人胚肺成纤维细胞(hpf)生长起促进作用，且呈剂量依赖性(p<0.05);pa与 cddp联合应用对sgc7901细胞生长的抑制具有协同作用(p<0.05);同时抑制端粒酶活性。结论 pa对胃癌sgc7901细胞有抑制作用,相同剂量对正常细胞无抑制作用。pa与cddp对胃癌细胞的抑制具有协同作用,与单用cddp相比,pa与cddp联合应用可减少cddp的用药剂量。
【关键词】 pa;cddp;体外研究;胃癌
【abstract】 objective to evaluate the effect of combination of paclitaxel (pa) and cisplatin (cddp) on the human gastric carcinoma cell sgc7901 in vitro. methods effects of pa and cddp were measured by mtt assay, and the interaction between these two agents was evaluated by the isobologram technique of berenbaum. cellular morphology was observed by phasecontrast, light microscope and electron microscope. flow cytometry was used for sgc7901 cell cycle analysis and measure telomerase. results pa significantly inhibited the growth of sgc7901 cell in a dose and timedependent way (p<0.05). numerous abnormal particles were found around the nucleus of sgc7901 cell under phasecontrast microscope, and also many materials in cytoplasm were found under light microscope, and also many dense materials in cytoplasm were found under electron microscope. pa significantly stimulated the growth of human embryonal pulmonary fibroblast (hpf) dose dependently (p<0.05). a strong synergism was found between pa and cddp in sgc7901 cells. pa induced g0/g1phase arrest but without statistical significance, and cddp significantly induced sphase arrest (p<0.05) in sgc7901 cells, and inhibited telomerase activity. conclusions pa can inhibit cell growth in gastric carcinoma cells but not in normal cells. pa and cddp have synergetic effect on the inhibition of gastric carcinoma cells. the combination of cddp and pa can reduce the cddp dose.
【key words】 paclitaxel; cisplatin; in vitro; gastric cancer
胃癌的发病率和恶性程度比较高，胃癌容易发生转移,其中人胃癌sgc7901细胞对多种化疗药物敏感。www.11665.cOm我国胃癌术后5年总生存率仍不足40%〔1〕。紫杉醇(pa)具有独特的抗癌机制和神奇的抗癌功效，被誉为近30年来天然抗癌药物研究领域最重大的发现〔2，3〕。本研究以人胃癌sgc7901细胞株为研究对象，观察了pa对胃癌细胞及正常人体细胞的作用，并进一步研究pa与常规化疗药物顺铂(cddp)联合应用对胃癌细胞作用的影响。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂和仪器
人胃癌sgc7901细胞、hpf由中国医学科学院提供，cddp由山东齐鲁制药厂生产，pa、碘化丙啶(pi)、rnase a、胎牛血清均购自sigma公司，rpmi1640培养基购自 gibco/brl公司，mtt由上海华舜生物工程有限公司生产， 全自动酶标仪为 multis ascent 公司产品，超纯水仪系purelab plus公司产品，流式细胞仪系facs calibur公司产品。
1.2 细胞培养
常规复苏人胃癌sgc7901细胞,按贴壁方法培养，细胞培养在经过0.22 μm滤膜过滤的rpmi1640培养液中(含10%热灭活胎牛血清，0.2%nahco3,青霉素100 u/ml和链霉素100 μg/ml),培养条件为37℃、5%的co2、饱和湿度。用pbs配制的0.15%的胰蛋白酶(含有0.02%的edta)消化细胞传代，每周传代1～2 次，收集指数生长期sgc7901细胞用于实验研究。hpf细胞培养同上。
1.3 单用pa对sgc7901和hpf细胞的作用
将浓度为5×104个/ml sgc7901细胞接种于8块96孔板，每孔200 μl，每种细胞设 3个复孔，37℃，5%的co2培养箱内培养。每日取一块培养板，弃培养液，加入无血清培养液180 μl，每孔加入mtt(5 g/l)20 μl，继续培养4 h，终止培养，弃培养液，加入二甲基亚砜150 μl，振荡5 min，以空白孔调零，用全自动酶标仪测定570 nm光吸收值。浓度为横坐标，细胞抑制率为纵坐标，绘制细胞生长曲线。选用 2、4、6、8、16、20 μg/ml 6个浓度的pa分别对sgc7901细胞和hpf细胞进行培养，pa用相应的培养液配制。对照组用含0.1%无水乙醇的培养液培养。培养24、48、72 h后行mtt检测，实验重复3次，结果取平均值。计算细胞增殖抑制率(%)=1-实验组平均od值/对照组平均od值×100%和半数抑制浓度(ic50)〔4〕。
1.4 cddp单用对sgc7901细胞的作用
选用 0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10、100 μg/ml 7个浓度的 cddp培养sgc7901细胞，cddp用相应的rpmi1640培养液配制，对照组用相应rpmi1640培养液培养。细胞浓度、培养方法、抑制率和 ic50的计算同1.3。
1.5 pa与 cddp联合应用对sgc7901 的作用
根据pa和cddp单独用药结果，得出两种药物的ic50值。采用序贯用药方式，首先用 ic50以下浓度为1、2、4、6、8、16、20 μg/ml的pa培养液分别培养sgc7901细胞 24 h，弃去培养液。然后换用 ic50以下浓度为0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10、100 μg/ml的 cddp继续培养24 h后终止作用，进行检测，计算 ic50值，对照组不含pa。pa选取1、2、4、6、8、16、20 μg/ml 7个浓度，计算48 h的 ic50值。cddp选取0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10、100 μg/ml 7个浓度，计算48 h的ic50值，合并指数=联合用药达到半数抑制浓度时甲用药量/甲单用时达到半数抑制浓度的用量+联合用药达到半数抑制浓度时乙用药量/乙单用时达到半数抑制浓度的用量。合并指数<0.95时表示两种药物有协同作用，合并指数>1.05 时两种药物有拮抗作用，0.96<合并指数<1.04时两种药物有相加作用〔5〕。
1.6 细胞形态学观察
1.6.1 光镜观察
设立pa组、cddp组、pa+cddp组，用pbs配制的0.15%的胰蛋白酶(含有0.02%的edta)消化细胞，制成5×104个/ml单细胞悬液接种于内铺小玻璃片的24孔培养板内，置于37℃，5% co2培养箱内培养48 h 后用0.1 mol/l pbs洗涤2 次，室温干燥，中性树胶封片处理，光镜下观察、拍照。
1.6.2 透射电镜观察
设立pa组、cddp组、pa+cddp组，sgc7901细胞在 100 ml培养瓶中贴壁后，加入处理药物，于 48 h终止反应，用 pbs液洗涤，轻轻用细胞刮将细胞刮下，离心后4%戊二醛固定 2 h以上，0.1 mol/l pbs (ph 7.2)冲洗，继续用20 mg/g的四氧化锇固定，脱水、包埋、切片和染色按常规处理，透射电镜(em208s,芬兰)观察、拍照。
1.7 流式细胞仪(fcm)分析细胞周期分布
细胞在 100 ml培养瓶中贴壁后，用含 0.5%胎牛血清 rpmi1640处理 24 h，使细胞同步于g0/g1期。换用含 10%胎牛血清培养液，加入不同浓度的处理药物，作用 48 h终止反应，pa+cddp组：sgc7901细胞于 pa作用 24 h后换用 cddp作用 至48 h终止反应，收集 1 ×106个细胞，用 pbs液洗涤，置于 4℃预冷乙醇 (70%) 中固定 12 h以上。rnase a处理细胞 30 min(37℃)，加入 pi溶液，每管样品检测10 000个细胞，实验重复2次，结果取平均值，上机检测细胞周期分布。
1.8 端粒酶〔
6〕活性测定 用无血清的rpmi1640培养液分别处理细胞0、12、24、36、48、60、72 h后，使细胞同步化后分组。a组：用不含血清的rpmi1640培养液作为对照;b组：加入含pa的无血清rpmi1640培养液，0、12、24、36、48、60、72 h后按telomerase试剂盒说明书标准程序进行检测。于570 nm波长下检测吸光度(a)值，并计算端粒酶的相对活性(%)。
1.9 统计学处理
采用sas统计软件包进行t检验。
2 结 果
2.1 pa对sgc7901细胞生长的影响
设立pa 共6个浓度对sgc7901细胞的生长均具有抑制作用，且抑制率随药物浓度的升高和作用时间的延长而增加(p<0.05)，作用24、48和72 h后的ic50值分别是1.8、5.1和5.9 μg/ml。在低浓度、24 h内对肿瘤细胞生长开始有抑制作用(见图1)。图1 pa对sgc7901细胞生长抑制曲线
2.2 pa对 hpf细胞生长的影响
设立 pa共 6个浓度，均对 hpf细胞生长起促进作用，且hpf细胞存活率随药物浓度的升高而增加(p<0.05)，但与作用时间无明显关系(p<0.05)(见图2)。图2 pa对hpf细胞生长促进曲线
2.3 cddp对sgc7901细胞生长的影响
设立 cddp 共7个浓度，对sgc7901细胞的生长均具有明显的抑制作用，抑制率随药物浓度的升高和作用时间的延长而增加(p<0.05) (见图3)。作用 24、48和 72 h后的ic50值分别是 0.21、0.35、0.44 μg/ml。
2.4 pa和cddp联合用药对sgc7901细胞生长的影响
pa选取1、2、4、6、8、16、20 μg/ml 7个浓度，处理48 h后的 ic50值为2.1 μg/ml(见图4)。cddp选取0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10、100 μg/ml 7个浓度，处理48 h后的ic50值为0.15 μg/ml(见图5)。合并用药后与单独用药比较，细胞抑制率明显增加，所使用的药物剂量在减少，2.1 μg/ml pa+0.15 μg/ml cddp的细胞抑制率显著增加。pa单独使用处理48 h后ic50图3 cddp对sgc7901细胞生长抑制曲线图4 pa和cddp联合应用对sgc7901细胞生长抑制影响是 5.1 μg/ml,cddp单独使用处理48 h后ic50是0.35 μg/ml;合并用药后,pa使用量处理48 h后ic50是2.1 μg/ml,cddp使用量处理48 h后ic50是0.15 μg/ml。合并指数是 0.83,提示2.1 μg/ml pa+0.15 μg/ml cddp联合用药有协同作用。
2.5 光镜观察细胞形态学结果
光镜下sgc7901细胞呈单层排列,细胞大小不一,为多角形,sgc7901细胞边界清楚,核大,圆形，联合用药组呈细胞死亡征象，细胞界限不清，细胞变圆，细胞核染色深，细胞质可见大量颗粒 (见图5)。
2.6 电镜观察细胞形态学结果
透射电镜下sgc7901细胞开始为正常状态,细胞质丰富,核仁多个,边界清晰,表面微绒毛丰富，联合用药组呈细胞死亡征象，细胞界限不清，细胞变圆，细胞核染色深，细胞质可见大量颗粒(见图6)。
2.7 细胞周期检测结果
对照组相比,单用pa和单用cddp对细胞增殖周期没有显著影响。pa和cddp合用对细胞增殖周期中的g2/m期有显著影响(p<0.05),提示细胞阻滞在s期,使sgc7901细胞的有丝分裂受到抑制,使肿瘤细胞数目减少,从而抑制细胞的生长 (见表1)。
2.8 药物对端粒酶活性的影响
设立pa组、cddp组、pa+cddp组，药物作用于sgc7901细胞0、12、24、36、48、60、72 h后，发现随时间的延长，则各组端粒体酶活性在逐渐下降，但是联合用药与单独用药 对端粒酶活性的影响不明显(见图7)。图5 sgc7901细胞形态学光镜下观察结果(×200)图6 sgc7901细胞形态学电镜观察(×10 000)表1 pa与ddp合用前后 sgc7901细胞周期图7 pa、cddp、pa+cddp分别作用于sgc7901细胞后端粒体酶活性变化
3 讨 论
胃癌是我国常见的恶性肿瘤,其死亡率居各类恶性肿瘤之首，且多数患者为进展期胃癌。联合化疗为其治疗的重要手段，但疗效差。这主要与化疗方案有密切关系。同时化疗对机体的毒副作用，比如骨髓抑制、免疫抑制、胃肠道反应等也是显而易见的。许多患者因为耐受不了而放弃治疗，更有一些身体状况不佳的患者因化疗而加速死亡。因此必须寻求新的药物配伍方案。pa已成为当前世界上最热门、最畅销、最紧缺、最昂贵以及临床上广泛使用的广谱抗癌药物。近年来，国内外文献均有报道pa对多种恶性肿瘤的发生、发展有抑制作用。cddp也不例外，也是目前经常使用的抗肿瘤药物。本研究将pa和cddp联合应用以期减少抗癌药物的用量〔6，7〕。
本研究结果提示两种药物可以配伍，并且还具有协同作用，同时加入pa的rpmi1640培养液对 hpf进行了培养，结果发现 pa对该细胞的作用不是抑制而是其促进生长，提示pa在抑制肿瘤细胞的同时对正常人体细胞并没有抑制作用，在人体应用相对安全〔8〕。本研究还对pa的作用机制做了初步探讨，发现 pa作用是将细胞阻滞于g0/g1期，提示 pa可以抑制细胞进入有丝分裂周期。经 cddp培养的细胞主要被阻滞于s期，使开始增殖的细胞无法进行分裂，提示 cddp也可以抑制细胞有丝分裂，两者合用可以在细胞周期的两个阶段对细胞进行抑制，解释了两者协同的原因;最后发现联合用药随时间的延长，则端粒酶活性也逐渐下降，但是联合用药与单独用药对端粒酶活性的影响不明显，这也提示检测两种药物联合应用对肿瘤细胞的研究结果时，mtt法检测两种药物单用和联合应用对细胞的作用、光镜和电镜观察细胞结构的变化、流式细胞仪检测sgc7901细胞周期分布与检测端粒酶活性相比较要明确。
综上所述，本研究证实pa对胃癌细胞株sgc7901具有抑制作用，对人体正常细胞hpf无抑制作用。pa与化疗药物cddp在抑制肿瘤细胞方面具有协同作用，cddp的应用可减少pa的用量。这为胃癌的新综合治疗方案提供了理论依据，但是否能应用于临床尚有待于进一步研究。
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